高 菲,范 恒

高菲,范恒,華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科 湖北省武漢市 430022

0 引言

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩病,是一種反復(fù)發(fā)作的慢性非特異性腸道炎性疾病,其發(fā)病機(jī)制涉及遺傳、環(huán)境、腸道屏障和免疫等多個(gè)方面,目前并不十分明確.我國(guó)現(xiàn)有的流行病學(xué)資料統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,IBD患病率、發(fā)病率均呈上升趨勢(shì),已成為我國(guó)的常見病和多發(fā)病.但目前針對(duì)IBD的治療欠佳,大部分治療方法及藥物只能緩解病情,患者需要長(zhǎng)期靠藥物維持病情穩(wěn)定,然而疾病仍易復(fù)發(fā).因此,尋找新的研究方向以便更有效治療IBD迫在眉睫.

熱休克蛋白5 (heat shock protein 5,HSPA5)又名葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (glucose-regulate d protein78,GRP78)和免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白,其主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,屬于熱休克蛋白70家族,參與多種疾病的發(fā)生及發(fā)展[1],抑制HSPA5/GRP78對(duì)癌癥和細(xì)菌及病毒感染都有治療作用,可作為多種疾病的治療靶點(diǎn),在IBD治療上也存在潛在可能[2,3].HSPA5 N端的ER信號(hào)序列和C端的KDEL檢索序列是區(qū)別于其他Hsp70蛋白獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征,使HSPA5能夠轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并保持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的形式[4].HSPA5具有調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)、介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)細(xì)胞凋亡、調(diào)控炎癥信號(hào)通路等與IBD發(fā)病相關(guān)的作用.有研究表明HSPA5/GRP78 mRNA和蛋白表達(dá)水平在IBD患者及鼠的腸組織中顯著高表達(dá)[5,6],尤其是在具有發(fā)達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells,IECs)中,當(dāng)IECs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)受到破壞時(shí)易發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[7].但HSPA5在IBD發(fā)展過程中具體的作用機(jī)制仍不清楚,本文從HSPA5的功能入手,就HSPA5對(duì)IBD發(fā)病的影響作一概述.

1 HSPA調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)主要是指蛋白質(zhì)合成受到病原體、炎性因子、缺血缺氧等持續(xù)性刺激后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)大量錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白蓄積導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能紊亂[7,8].HSPA5作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵因子,能夠通過多條途徑減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的未/錯(cuò)折疊蛋白,恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài).

未受刺激時(shí),HSPA5與肌醇需要蛋白1 (inositol requiring enzyme 1,IRE1)、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、活化轉(zhuǎn)錄因子6 (activating transcription factor-6,ATF6) 3種應(yīng)激信號(hào)跨膜感受蛋白穩(wěn)定結(jié)合并處于無活性狀態(tài)；當(dāng)受到病原體、炎性因子、缺血缺氧等持續(xù)性刺激時(shí)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集的未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶HSPA5,使HSPA5與IRE1、PERK、ATF6解離,激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),引發(fā)一系列反應(yīng)來處理錯(cuò)/未折疊蛋白,恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài),這些反應(yīng)稱為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)[9].

首先,當(dāng)ERS發(fā)生時(shí),HSPA5與PERK解離后使之發(fā)生磷酸化,其激酶域結(jié)構(gòu)被激活,進(jìn)一步活化eIF2α,活化的eIF2α在蛋白合成的早期與葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶及tRNA形成三聚體復(fù)合物,從而導(dǎo)致整體翻譯停滯,但允許翻譯適應(yīng)性UPR必需的蛋白質(zhì)[10],從而阻止ERS早期未/錯(cuò)折疊蛋白質(zhì)的合成.其次,HSPA5一方面可以通過核苷酸結(jié)合域和底物結(jié)合域兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,直接與未/錯(cuò)折疊蛋白結(jié)合使其正確折疊[4]；另一方面,HSPA5與IRE1、ATF6解離后使之發(fā)生磷酸化,活化的IRE1激活下游因子XBP1形成有活性的轉(zhuǎn)錄因子-XBP1s,ATF6活化后釋放出N末端片斷與通用型核轉(zhuǎn)錄因子NF-Y片段結(jié)合形成異源二聚體,XBP1s和異源二聚體都作用于ERS元件(ERSE)的特定序列上調(diào)HSPA5[11,12],從而正確折疊未/錯(cuò)折疊蛋白.最后,HSPA5參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解(reticulum-associated degradation,ERAD),即錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)則被識(shí)別后從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)桨麧{中,隨后被蛋白酶體泛素化和降解的過程.動(dòng)物細(xì)胞中,IRE1α和IRE1β是IRE1的2種細(xì)胞亞型,IRE1α是UPR中的主要參與者,新的研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí),HASP5與IRE1α解離,激活I(lǐng)RE1α信號(hào)通路,活化XBP1,XBP1s的過度表達(dá)增加了ERAD成分Sel1L、Hrd1和Os9的表達(dá)[13],促進(jìn)未/錯(cuò)折疊蛋白的降解；此外,HSPA5負(fù)責(zé)維持ER在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的通透性屏障,以錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)為靶點(diǎn)進(jìn)行逆行轉(zhuǎn)運(yùn),使其能被蛋白酶體降解[14].HSPA5阻止未/錯(cuò)折疊蛋白的合成、使已合成的蛋白正確折疊,促使不能正確折疊的蛋白降解,從而減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未/錯(cuò)折疊蛋白,恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài),利于細(xì)胞存活.

IBD的一個(gè)主要特征是杯狀細(xì)胞病理學(xué),通常被描述為杯狀細(xì)胞耗竭.杯狀細(xì)胞是腸粘膜屏障第一道防線黏液層的主要構(gòu)成,它的耗竭大大減弱了其阻止抗原接觸腸腔細(xì)胞的能力.MUC2是消化道中的杯狀細(xì)胞主要分泌黏蛋白,其合成的復(fù)雜性使其容易在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)折疊,杯狀細(xì)胞凋亡由錯(cuò)誤折疊的MUC2增加引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高所驅(qū)動(dòng)的,糾正MUC2折疊,抑制活性氧,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,挽救細(xì)胞凋亡[15].有研究發(fā)現(xiàn)小鼠的杯狀細(xì)胞中MUC2蛋白錯(cuò)誤折疊,引起HSPA5上調(diào),ERS和UPR被激活,開始時(shí)HSPA5代償性增高以處理錯(cuò)折疊的MUC2蛋白,然而持續(xù)的ERS會(huì)導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷并誘發(fā)腸道炎癥,其腸道病變表現(xiàn)為杯狀細(xì)胞缺失、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、腸上皮損傷,與人的UC表現(xiàn)相似,此時(shí)HSPA5過表達(dá).杯狀細(xì)胞對(duì)應(yīng)激源高度敏感,導(dǎo)致它們?cè)谠绨l(fā)性結(jié)腸炎期間優(yōu)先凋亡,這可能是使疾病持續(xù)發(fā)展的早期事件之一.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期,HSPA5上調(diào)增強(qiáng)MUC2的折疊,有助于緩解杯狀細(xì)胞的損耗,保持粘膜屏障的完整性,更好地管理IBD[16].

2 HSPA5介導(dǎo)凋亡信號(hào)通路

當(dāng)ERS劇烈持續(xù)時(shí),未折疊蛋白反應(yīng)不能完全代償緩解細(xì)胞損害,為維持內(nèi)穩(wěn)態(tài),UPR將激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路,如C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)途徑、Jun-N-末端激酶(c-Jun-N-terminal kinase,JNK)/p-JNK途徑、Caspase途徑等[17].

IRE1與GRP78/HSPA5解離后會(huì)觸發(fā)IRE1寡聚化以促進(jìn)激酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生自身磷酸化,然后與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2和凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1結(jié)合形成復(fù)合物,導(dǎo)致JNK下游激活[18].

PERK與GRP78/HSPA5解離后會(huì)自體磷酸化和低聚化,elF2α磷酸化能夠使ATF4表達(dá)增加,使ATF4介導(dǎo)的CHOP活化.ATF6與GRP78/HSPA5解離后被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體,由S1P和S2P兩種蛋白酶順序切割.被切下的ATF6 N端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)入細(xì)胞核,與ATF/cAMP反應(yīng)元件SANO和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件結(jié)合,激活靶基因CHOP[19].IRE1途徑激活的JNK可以上調(diào)CHOP的表達(dá)[20].ERS的3條通路都能誘導(dǎo)CHOP激活,而ATF4被認(rèn)為是主要誘導(dǎo)CHOP轉(zhuǎn)錄的因子.

正常狀態(tài)下Caspase 12與GRP78/HSPA5形成復(fù)合體而滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面,使Caspase 12處于無活性狀態(tài).當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)24 h后,Caspase 12與GRP78/HSPA5發(fā)生解離,游離的Caspase 12直接激活Caspase 9繼而活化Caspase 3等引起一系列下游級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,因此游離的Caspase 12可不經(jīng)線粒體細(xì)胞色素c和凋亡蛋白酶激活因子-1途徑直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21].人類的Caspase4與鼠類的Caspase12是同源蛋白質(zhì),二者具有基因序列同源性[22].

細(xì)胞凋亡本是ERS過強(qiáng)時(shí)的一種保護(hù)機(jī)制,以清除多余的受損細(xì)胞,可減少組織受損,但對(duì)于IBD而言,腸上皮細(xì)胞凋亡過度形成“凋亡漏”,破環(huán)了腸道屏障,使病原體輕易進(jìn)入腸道引發(fā)炎癥,未被吞噬清除的凋亡細(xì)胞引發(fā)免疫調(diào)節(jié)失常[23-25],伴隨數(shù)量的減少,IECs抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)等功能減弱[7].郭騰飛等[26]發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組比較,葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎組小鼠結(jié)腸組織中GRP78/HSPA5、ATF6和CHOP mRNA和蛋白表達(dá)水平升高.GRP78/HSPA5主要表達(dá)于結(jié)腸上皮細(xì)胞的胞質(zhì)及胞膜,ATF6主要表達(dá)于結(jié)腸上皮細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核,CHOP主要表達(dá)于結(jié)腸上皮細(xì)胞的胞核中,表明GRP78/HSPA5-ATF6-CHOP通路相關(guān)分子可能在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用.沈雁等[27]研究發(fā)現(xiàn)與DSS空白組比較,模型組小鼠結(jié)腸組織IECs凋亡數(shù)明顯增多,GRP78/HSPA5、Caspase-12和Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高,GRP78mRNA的表達(dá)亦上調(diào).而與模型組比較,小檗堿(Berberine,BBR)組IECs凋亡數(shù)明顯下降,小鼠結(jié)腸組織GRP78/HSPA5、Caspase-12、Caspase-3蛋白表達(dá)水平與HSPA5mRNA的表達(dá)水平均下調(diào),表明BBR有效減輕UC小鼠的結(jié)腸炎癥,其機(jī)制可能與抑制HSPA5下調(diào)ERS水平,抑制ERS介導(dǎo)的Caspase-12/Caspase-3凋亡信號(hào)通路活化有關(guān).

3 HSPA5激活核轉(zhuǎn)錄因子κB炎癥信號(hào)通路

應(yīng)激狀態(tài)下,HSPA5從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上解離和IRE1、PERK和ATF6鏈接狀態(tài),激活這3個(gè)基因相關(guān)通路及其下游調(diào)控的核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear factor-κB,NF-κB)炎癥信號(hào)通路,引起炎癥反應(yīng).當(dāng)應(yīng)激過度時(shí),HSPA5過表達(dá),炎癥反應(yīng)也相應(yīng)過度增強(qiáng),損傷機(jī)體組織器官,引起病變.

PERK的激活和伴隨的翻譯抑制導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制分子(inhibitor of NF-κB,IκB) α合成減少,NF-κB入核增加,短壽命IκB蛋白與長(zhǎng)壽命NF-κB蛋白的比例失衡,從而致NF-κB的激活,獨(dú)立于IκB磷酸化[28].IRE-1與TRAF-2結(jié)合后能募集核因子κB抑制蛋白激酶觸發(fā)IκB激酶和IκB磷酸化.ATF6通過蛋白激酶B磷酸化激活NF-κB.

大量研究已經(jīng)證實(shí)IBD的炎性損傷與NF-κB過度或持續(xù)激活密切相關(guān).激活后的NF-κB入核誘導(dǎo)TNF-α、IL-6、IL1β等炎性因子的表達(dá),使得腸道屏障破壞,而這些細(xì)胞因子又能夠作為NF-κB的刺激劑,可進(jìn)一步活化NF-κB,造成持續(xù)或放大的炎癥反應(yīng)[29].Awada等[30]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期食用氧化的n-3多不飽和脂肪酸的高脂飼料的小鼠小腸組織HSPA5/GRP78、NF-κB、CHOP的表達(dá)顯著升高伴隨著Paneth細(xì)胞數(shù)量的減少.可能是由于氧化因素的長(zhǎng)期刺激使Paneth細(xì)胞處于過度應(yīng)激狀態(tài),GRP78過度表達(dá),激活下游NF-κB、CHOP通路,促使Paneth細(xì)胞凋亡.Paneth細(xì)胞是腸上皮細(xì)胞中重要的分泌細(xì)胞,分泌抗菌肽維持腸道菌群動(dòng)態(tài)平衡[31],缺少Paneth細(xì)胞,腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)破壞,防御病原功能減弱致IBD進(jìn)展.

圖1 熱休克蛋白5在炎癥性腸病中影響腸上皮細(xì)胞存活及凋亡的機(jī)制.ERS：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；HSPA5：熱休克蛋白5；UP：錯(cuò)/未折疊蛋白；IBD：炎癥性腸?。籌RE：肌醇需要蛋白；ATF：活化轉(zhuǎn)錄因子；PERK：蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶；NF：核轉(zhuǎn)錄因子；JNK：Jun-N-末端激酶；CHOP：C/EBP同源蛋白；TNF：腫瘤壞死因子；IL：白介素.

4 結(jié)論

在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期即適應(yīng)性應(yīng)激狀態(tài)下,HSPA5通過3條內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑代償性高表達(dá)處理內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的未/錯(cuò)折疊蛋白恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài),從而保護(hù)腸上皮細(xì)胞,但當(dāng)應(yīng)激時(shí)間過長(zhǎng)或者強(qiáng)度過高即ER過度應(yīng)激時(shí),HSPA5處理蛋白的負(fù)荷過重,它將激活凋亡信號(hào)通路和炎癥信號(hào)通路凋亡通路和炎性通路激活,促細(xì)胞凋亡作用占主導(dǎo).IBD發(fā)生時(shí),腸上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激,HSPA5的致細(xì)胞凋亡作用遠(yuǎn)大于其保護(hù)細(xì)胞的作用.因此,可以將過表達(dá)的HSPA5看作是IBD腸上皮細(xì)胞存活的危險(xiǎn)因素(圖1).目前IBD領(lǐng)域的大多數(shù)研究主要集中在產(chǎn)生組織損傷的因子和過程上,而很少考慮細(xì)胞保護(hù)和細(xì)胞修復(fù)的內(nèi)在機(jī)制,HSPA5在IBD發(fā)病中的分子機(jī)制研究尚少,我們需要進(jìn)一步研究其在IBD腸上皮細(xì)胞存活中的相關(guān)作用機(jī)制,探究其是否可以作為IBD的新的治療靶點(diǎn),從而為IBD的治療提供新的方向.本文僅就內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的HSPA5對(duì)細(xì)胞存活的影響作一闡述,細(xì)胞外的HSPA5對(duì)細(xì)胞存活的影響尚需作進(jìn)一步研究.