孫建賀,侯計(jì)平,康永振

孫建賀,侯計(jì)平,康永振,天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院肝膽外科 天津市301800

0 引言

在全球范圍內(nèi),肝癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,尤其是東亞人群,由于乙肝慢性肝炎患者數(shù)量巨大,乙肝-肝硬化-肝癌的發(fā)生率顯著高于歐美國家[1,2].目前,肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)已經(jīng)成為一個(gè)重大的全球健康問題.HCC在亞洲和非洲等地區(qū)發(fā)病率較高,主要?dú)w因于黃曲霉毒素的膳食暴露及慢性乙型肝炎病毒感染[3,4],而西方歐美國家發(fā)病率相對較低[5].

眾所周知,轉(zhuǎn)移是大多數(shù)癌癥患者的最終死因,轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)也是HCC患者死亡和治療失敗的主要原因.近年來研究顯示,PPP1R105 (Ki-67或MKI67)編碼種與細(xì)胞增殖有關(guān)的核蛋白.PPP1R105編碼蛋白(也稱為MKI67)是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物,在細(xì)胞靜休期,PPP1R1057抗原只能在細(xì)胞核內(nèi)檢測到,而在有絲分裂過程中,大部分蛋白質(zhì)被重新定位到染色體表面PPP1R105蛋白存在于細(xì)胞周期的所有活躍階段(G1、S、G2和有絲分裂),但靜息(靜止)細(xì)胞(G0)中不存在PPP1R105蛋白.已有研究顯示,在多種腫瘤中高表達(dá)并與患者的預(yù)后不良有關(guān)[6,7].PPP1R105編碼蛋白是一種核蛋白,并作為腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)標(biāo)記物.已有研究也發(fā)現(xiàn)PPP1R105與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8].但PPP1R105作為肝細(xì)胞癌患者預(yù)后分子標(biāo)記物及其作為肝細(xì)胞癌治療靶點(diǎn)的研究報(bào)道較少.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 PPP1R105表達(dá)水平分析：在腫瘤蛋白數(shù)據(jù)庫[9]和TCGA數(shù)據(jù)中(https：//portal.gdc.cancer.gov/),檢索PPP1R105基因在各個(gè)腫瘤組織中的相對表達(dá)情況；在TCGA數(shù)據(jù)庫在線分析軟件GEPIA[10](http：//gepia.cancerpku.cn/detail.php)中分析PPP1R105基因在肝細(xì)胞癌組織和癌旁組織中的相對表達(dá)情況,并比較是否存在差異.同時(shí)分析其PPP1R105 mRNA相對表達(dá)水平與患者臨床分期的關(guān)系.

1.1.2 PPP1R105蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)：應(yīng)用蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫STRING[11](http：//string-db.org/cgi/input.pl)構(gòu)建PPP1R105基因編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建條件為,蛋白間相互作用信度0.7,相互作用蛋白不高于20個(gè)(前20),相互作用來源為共表達(dá)、基因功能和比鄰關(guān)系.

1.1.3 共表達(dá)分析：采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)對PPP1R105共表達(dá)基因進(jìn)行了聚類分析,同時(shí)對PPP1R105正相關(guān)和負(fù)相關(guān)共表達(dá)的top2基因進(jìn)行了相關(guān)性檢驗(yàn).

1.1.4 生存分析：TCGA數(shù)據(jù)庫中,根據(jù)PPP1R105 mRNA在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)的中位數(shù)將患者分為PPP1R105高表達(dá)(＞PPP1R105 mRNA中位數(shù))和低表達(dá)(≤PPP1R105 mRNA中位數(shù))組.依據(jù)風(fēng)險(xiǎn)比例模型繪制高低表達(dá)組患者的生存曲線,對曲線進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn),計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比.

1.2 方法

1.2.1 IHC檢測PPP1R105表達(dá)：選取我院手術(shù)治療的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者81例進(jìn)行回顧性分析,同時(shí)于病理科選取對應(yīng)患者的組織蠟塊標(biāo)本,采用免疫組織化學(xué)法檢測肝細(xì)胞癌組織中PPP1R105蛋白表達(dá)情況,并與患者的臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析.PPP1R105蛋白表達(dá)按試劑盒說明進(jìn)行(PPP1R105兔多克隆抗體,購自Abcam中國公司,上海市浦東新區(qū)伽利略路338號).

1.2.2 PPP1R105高低表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)：選取2個(gè)高倍視野,通過基于強(qiáng)度和異質(zhì)性的快速評分法(Q-score) 進(jìn)行半定量評分,具體評分標(biāo)準(zhǔn)及分值見表1.每份樣本的Q-score得分是染色強(qiáng)度和陽性染色細(xì)胞百分比評分的總和,總評分范圍為0-7分,Q-score≥2分為高表達(dá),Q-score＜2分為低表達(dá)[12].

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料應(yīng)用mean±SD表示,ANVOA檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用n表示,χ2檢驗(yàn)；生存分析采用K-M法,P＜0.05為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 PPP1R105基因mRNA表達(dá) PPP1R105基因mRNA在不同腫瘤中表達(dá)水平差異并不顯著,其表達(dá)特不具備腫瘤間特異性(圖1A).但在大多數(shù)腫瘤組織中,其表達(dá)水平均高于對應(yīng)的正常組織(圖1B).在肝細(xì)胞癌中,癌組織中PPP1R105 mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁正常肝組織(圖1C)且表達(dá)水平與患者臨床分期有關(guān)(圖1D).

2.2 PPP1R105基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) PPP1R105基因編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中篩選出20個(gè)相關(guān)基因,相互作用關(guān)系為191,平均相互作用指數(shù)為18.2,區(qū)域聚集指數(shù)為0.99,蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)富集明顯(P＜0.01),圖2.

2.3 GO富集 PPP1R105及其相關(guān)基生物學(xué)功能、細(xì)胞成分和分子功能富集見表2.因生物學(xué)過程主要富集于有絲分裂染色體向紡錘體極運(yùn)動、減數(shù)分裂姐妹染色單體結(jié)合,著絲粒和有絲分裂紡錘體裝配檢查點(diǎn),圖3.細(xì)胞成分主要富集于染色體復(fù)合體、紡錘中間區(qū)和紡錘體微管等,圖4.分子功能主要富集于微管運(yùn)動活性、蛋白C末端結(jié)合和組蛋白脫乙酰酶結(jié)合等,圖5.

2.4 PPP1R105及其相關(guān)基因KEGG信號通路富集PPP1R105及其相關(guān)基因KEGG信號通路富集見表3.PPP1R105及其相關(guān)基因信號通路主要富集于細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老、病毒致癌及p53信號通路,圖6.

2.5 與PPP1R105共表達(dá)基因分析 對與PPP1R105共表達(dá)基進(jìn)行分析,并采用聚類熱圖(圖7)進(jìn)行表示.同時(shí)發(fā)現(xiàn)KIF18B與PPP1R105正相關(guān)表達(dá)最為顯著(rpearson=0.91,P＜0.05)；而MCELL基因與PPP1R105負(fù)相關(guān)表達(dá)最為顯著(rpearson=-0.59,P＜0.05),圖8.

2.6 生存分析 TCGA數(shù)據(jù)庫中,根據(jù)PPP1R105 mRNA 在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)的中位數(shù)將患者分為PPP1R105高表達(dá)(＞PPP1R105 mRNA中位數(shù))和低表達(dá)(≤PPP1R105 mRNA中位數(shù))組.PPP1R105高表達(dá)組DFS (HR=1.90,P＜0.01)和OS (HR=1.90,P＜0.01)顯著低于低表達(dá)組,圖9.

表1 PPP1R105高低表達(dá)評分標(biāo)準(zhǔn)

圖1 PPP1R105基因在不同腫瘤及肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況.A：PPP1R105 mRNA在不同腫瘤中的表達(dá)；B：PPP1R105基因在多種腫瘤組織于癌旁組織中的表達(dá)比較；C：PPP1R105基因mRNA在肝細(xì)胞癌和正常肝組織中的表達(dá)比較；D：PPP1R105 mRNA在不同臨床分期患者中的表達(dá)水平比較.

2.7 免疫組化檢測PPP1R105表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色顯示,PPP1R105蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核,陽性表達(dá)呈現(xiàn)黃棕色顆粒狀,均勻分布于細(xì)胞核內(nèi).81例患者中高表達(dá)者30例(37.0%)低表達(dá)者51 (63.0%)例,圖10.

2.8 PPP1R105蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者特征 PPP1R105蛋白高表達(dá)患者腫瘤大于5 cm及TNM分期Ⅲa期患者比例顯著高于MIK67蛋白低表達(dá)者,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),表4.

3 討論

PPP1R105基因定位于人10號染色體,編碼一種核蛋白,該蛋白與細(xì)胞增殖相關(guān),可能是細(xì)胞增殖所必需的蛋白因子.在細(xì)胞分裂增殖的過程中,除G0期外PPP1R105蛋白在其他細(xì)胞周期各個(gè)階段均有不同程度的表達(dá),因此PPP1R105蛋白被認(rèn)為是反映細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志物.

表2 PPP1R105及其相關(guān)基因GO富集

在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)PPP1R105基因mRNA在不同腫瘤中表達(dá)水平差異并不顯著,但在大多數(shù)腫瘤組織中均呈現(xiàn)較高水平的表達(dá),這與腫瘤細(xì)胞增殖活躍有關(guān).在肝細(xì)胞癌中,癌組織中PPP1R105 mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁正常肝組織,且表達(dá)水平與患者臨床分期有關(guān).提示肝癌中,PPP1R105 mRNA呈現(xiàn)上調(diào),且分期越晚,表達(dá)水平越高.同時(shí)信號通路富集也證實(shí)PPP1R105信號通路富集于細(xì)胞周期.從上述多個(gè)方面證實(shí)PPP1R105基因編碼蛋白主要生物學(xué)功能與細(xì)胞分裂增殖有關(guān).進(jìn)一步免疫組化顯示,PPP1R105高表達(dá)患者腫瘤較大、TNM分期較晚.這些特征均為肝細(xì)胞癌預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素.生存分析也同時(shí)證實(shí),PPP1R105高表達(dá)患者總生存期和無疾病進(jìn)展生存期均低于低表達(dá)者,提示PPP1R105是肝細(xì)胞癌預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素.

表3 MIK67及其相關(guān)關(guān)基因功KEGG信號通路富集

表4 PPP1R105蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床特征

盡管PPP1R105的表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān),但在分子功能研究中,PPP1R105在細(xì)胞周期不同階段的生物學(xué)功能也不盡相同.在早期研究中,注射抗PPP1R105抗體可抑制小鼠3T3細(xì)胞的增殖[13].同時(shí),小干擾RNA下調(diào)IM-9多發(fā)性髓鞘瘤和RT-4膀胱癌細(xì)胞系中PPP1R105基因表達(dá)后,細(xì)胞的增殖能力明顯降低[14,15].然而,新近的研究表明,PPP1R105缺失對人類細(xì)胞周期進(jìn)程不同階段影響不同,其功能與G1/S檢查點(diǎn)的狀態(tài)有關(guān).人成纖維細(xì)胞(WI-38、IMR90和HFF)以及非腫瘤來源的二倍體細(xì)胞(hTERT-RPE1和hTERT-BJ)在PPP1R105缺失時(shí)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生周期蛋白依賴性激酶抑制劑檢查點(diǎn)蛋白p21[16].因此,這些細(xì)胞被稱為“PPP1R105敏感細(xì)胞”與“PPP1R105敏感”細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞系(HeLa、U2OS和293T細(xì)胞)在PPP1R105缺失時(shí)不誘導(dǎo)p21或顯示S期改變[17].因此認(rèn)為PPP1R105蛋白的生物學(xué)功能是細(xì)胞周期依賴的.

圖3 PPP1R105及其相關(guān)基因生物學(xué)過程富集氣泡圖.

圖4 PPP1R105及其相關(guān)基因細(xì)胞成分程富集氣泡圖.

圖5 PPP1R105及其相關(guān)基因分子功能富集氣泡圖.

圖6 MIK67及其相關(guān)基因功KEGG信號通路富集圖.

圖7 與PPP1R105共表達(dá)基因聚類熱圖. A：正相關(guān)共表達(dá)聚類熱圖；B：負(fù)相關(guān)共表達(dá)聚類熱圖.

圖8 與PPP1R105正負(fù)相關(guān)表達(dá)基因散點(diǎn)圖.A：KIF18B與PPP1R105正相關(guān)表達(dá)最為顯著；B：MCELL基因與PPP1R105負(fù)相關(guān)表達(dá)最為顯著.

本研究對PPP1R105在腫瘤尤其是肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及生物學(xué)功能進(jìn)行生物信息學(xué)分析,證實(shí)PPP1R105主要與細(xì)胞周期有關(guān).同時(shí)證實(shí),PPP1R105是肝細(xì)胞癌預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素.同時(shí),隨著大數(shù)據(jù)和人工智能在醫(yī)學(xué)尤其是腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用,大數(shù)據(jù)深入挖掘有望為惡性腫瘤的診斷和治療提供新的思路和方法.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

PPP1R105基因mRNA在多種惡性腫瘤中表達(dá)水平上調(diào),PPP1R105基因mRNA在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中表達(dá)、生物學(xué)功能及其表達(dá)水平與患者預(yù)后關(guān)系研究鮮有報(bào)道.

圖9 PPP1R105 mRNA高低表達(dá)組肝細(xì)胞癌患者總生存和無疾病進(jìn)展生存曲線.

圖10 免疫組化檢測PPP1R105蛋白表在肝細(xì)胞癌和正常肝組織中的表達(dá).

實(shí)驗(yàn)動機(jī)

通過本研究進(jìn)一步明確PPP1R10基因mRNA在HCC中的表達(dá)水平、相關(guān)生物學(xué)功能、信號通路及其作為HCC預(yù)后分子標(biāo)志物的可行性.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

評價(jià)PPP1R10基因mRNA在HCC中的表達(dá)及其臨床意義.

實(shí)驗(yàn)方法

對比PPP1R105基因在HCC及其他各個(gè)腫瘤組織中的相對表達(dá)情況.構(gòu)建PPP1R105基因編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò).比較PPP1R105高低表達(dá)組患者無疾病進(jìn)展生存(disease free survival,DFS)和總生存(overall survival,OS)是否存在差異.采用免疫組織化學(xué)法檢測肝細(xì)胞癌組織中PPP1R105蛋白表達(dá)情況,并與患者的臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PPP1R105基因mRNA在HCC癌組織達(dá)水平顯著上調(diào),并與患者的DFS和OS降低有關(guān).PPP1R105及其相關(guān)基因信號通路主要富集于細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老、病毒致癌及p53信號通路.PPP1R105蛋白高表達(dá)患者腫瘤大于5 cm及TNM分期Ⅲa期患者比例顯著高于MIK67蛋白低表達(dá)者.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

肝細(xì)胞癌患者PPP1R105高表達(dá),其與患者總生存和無疾病進(jìn)展生存較短有關(guān),可作為肝細(xì)胞癌患者預(yù)后不良分子標(biāo)志物.

展望前景

PPP1R105可能是HCC預(yù)后不良發(fā)獨(dú)立危險(xiǎn)因素,進(jìn)一步對PPP1R105相關(guān)信號通路進(jìn)行研究,為開發(fā)抑制PPP1R105表達(dá)的HCC靶向治療藥物提供了新的靶點(diǎn).