孫賓娟

益氣生血膠囊是結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)及諸代醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)相傳，應(yīng)用現(xiàn)代技術(shù)所制備的中藥制劑，其組方為黃芪、當(dāng)歸、連翹，其功效為益氣生血，針對(duì)面色、爪甲蒼白，神疲乏力，頭暈?zāi)垦?，心悸不寐，肌熱面熱，月?jīng)過(guò)多等癥有較好的治療作用[1-2]。由于益氣生血膠囊為自制的膠囊劑，尚未對(duì)其建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；綜合考慮其組方中當(dāng)歸，連翹成分的鑒別、含量測(cè)定方法較多且成熟[3]，故本次研究針對(duì)黃芪中的黃芪甲苷建立含量測(cè)定方法。而結(jié)合多項(xiàng)研究[4-5]結(jié)果可知，黃芪甲苷峰與雜質(zhì)峰極性較為相似，較容易與雜質(zhì)峰出現(xiàn)包峰情況，故本次研究采用反相高效液相色譜法對(duì)黃芪甲苷進(jìn)行測(cè)定，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent科技有效公司提供，型號(hào)1100)、真空脫氣機(jī)(型號(hào)G1379A)、四元泵(型號(hào)G1311A)、自動(dòng)進(jìn)樣器(型號(hào)G1313A)、紫外檢測(cè)器(型號(hào)G1314A)、HPChemB01.03工作站、數(shù)控超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司提供，型號(hào)KQ-600DV)、高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠提供，型號(hào)GL-12B)、純水儀(北京力源電子儀器有限公司提供，型號(hào)ED2N)、十萬(wàn)分之一電子分析天平(德國(guó)Sartorius科學(xué)儀器公司提供，型號(hào)CP225D)及pH計(jì)(德國(guó)Sartorius科學(xué)儀器公司提供，型號(hào)PB-10)。

1.2 試劑 甲醇、乙腈(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，高效液相色譜淋洗劑)、乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)、磷酸(西隴科學(xué)股份有限公司，分析純)D101大孔樹(shù)脂(15 mm×20 mm，廊坊圣泉化工有限公司)及純化水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.3 試藥 益氣生血膠囊 (院內(nèi)自制，批號(hào)190101、190202、190303)及黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)110781-200613)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱，規(guī)格為150 mm×3.9 mm，5 μm；流動(dòng)相：乙腈- 0.1磷酸溶液(30∶70)；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：207 nm；進(jìn)樣量：25 μL。樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖(見(jiàn)圖1～2)，色譜圖表明在該條件下，黃芪甲苷顯現(xiàn)良好。

圖1 黃芪甲苷對(duì)照品色譜圖(1為黃芪甲苷)

圖2 益氣生血膠囊樣品色譜圖(1為黃芪甲苷)

2.2 供試品溶液制備 精密稱量膠囊內(nèi)容物5 g，置于索氏提取器中，加入甲醇50 mL，冷浸12 h，再加入適量甲醇，于95℃下水浴加熱回流6 h，收集所提取的甲醇，置95℃下水浴蒸干，以水10 mL在60～80℃條件下溶解殘?jiān)?，以水飽和的正丁醇萃?次，20 mL/次，收集并合并正丁醇液，以氨試液對(duì)正丁醇提取液洗滌2次，40 mL/次，收集并合并正丁醇液，置95℃下水浴蒸干，殘?jiān)约状汲浞秩芙?，并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶，加甲醇至容量瓶刻度，定容，搖勻，置超聲清洗器下超聲，即為供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液制備 將黃芪甲苷對(duì)照品于60 ℃下減壓干燥24 h，立即精密稱量10 mg，并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶，加甲醇至容量瓶刻度，定容，搖勻，即為2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以甲醇對(duì)2 mg/mL黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，制備不同含量的黃芪甲苷溶液，含量分別為0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL及2 mg/mL；參照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣濃度為X坐標(biāo)，以峰面積為Y坐標(biāo)建立線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y＝32 112＋68 750X(r＝0.999 8)，線性范圍為0.01～2 mg/mL。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 參照2.4項(xiàng)下的配制方法，制備不同含量的黃芪甲苷溶液，含量分別為0.03 mg/mL、0.06 mg/mL、1 mg/mL；參考2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，將3個(gè)不同濃度的黃芪甲苷溶液各進(jìn)5樣本，連續(xù)測(cè)定3 d，結(jié)合黃芪甲苷的峰面積數(shù)據(jù)，分別計(jì)算其日內(nèi)精密度及日間精密度，結(jié)果表明0.03 mg/mL黃芪甲苷溶液日內(nèi)與日間精密度分別為1.34%及1.67%，0.06 mg/mL黃芪甲苷溶液日內(nèi)與日間精密度分別為1.47%及1.59%，1 mg/mL黃芪甲苷溶液日內(nèi)與日間精密度分別為1.89%及1.97%；即以該方法進(jìn)行測(cè)定，其日內(nèi)及日間精密度結(jié)果尚可。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別將其放置0、6、12、24、48 h后，進(jìn)樣25 μL，記錄其峰面積數(shù)據(jù)[6-7]。結(jié)果表明供試品在放置不同時(shí)間后，其RSD值為2.14%；即供試品在48 h內(nèi)可持續(xù)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 參照2.2項(xiàng)下的供試品溶液制備方法，將3批膠囊樣品分別各制備5份供試品溶液，參照2.1項(xiàng)下的色譜條件，分別測(cè)定各供試品的黃芪甲苷含量，計(jì)算其含量平均值為1.25 mg/mL，RSD值為2.54%；即以該方法進(jìn)行測(cè)定，其重復(fù)性尚可。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn) 參照2.2項(xiàng)下的供試品溶液制備方法，將已知含量的3份益氣生血膠囊 (批號(hào)190101，黃芪甲苷含量1.25 mg/mL)所制供試品溶液，分別加入3份黃芪甲苷對(duì)照品溶液中(含量分別為2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL)，在相同色譜條件下對(duì)黃芪甲苷含量進(jìn)行測(cè)定，每份混合溶液各測(cè)定3次，并計(jì)算其平均回收率值為96.5%，平均RSD值為2.38%。

2.9 樣品測(cè)定 將3個(gè)不同批號(hào)的益氣生血膠囊樣品參照2.2項(xiàng)下的供試品溶液制備及2.3項(xiàng)下的對(duì)照品溶液制備進(jìn)行黃芪甲苷的含量分析，參照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄并分析其圖譜，采用外標(biāo)法對(duì)黃芪甲苷的含量進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果分別為1.24 mg/mL、1.26 mg/mL及1.28 mg/mL。

3 討論

3.1 樣品處理方法研究 黃芪甲苷本質(zhì)為黃芪多糖，是黃芪中的主要有效成分之一[8-10]，其生物活性為3種黃芪苷中最好的，以甲醇作為溶劑、以加熱回流的方式對(duì)樣品進(jìn)行提取，且在提取前將樣品冷浸于溶劑中12 h，能夠使黃芪甲苷在其中更為充分溶解，使得提取率大大增加[11-12]；而后采用水飽和的正丁醇對(duì)樣品進(jìn)行萃取，并以氨試液進(jìn)行洗滌，可有效提升黃芪甲苷的提取率，除去供試品溶液中的部分雜質(zhì)[13]，最終所得圖譜表明，在黃芪甲苷出峰處雜質(zhì)峰較少，故以此處理樣品所得的供試品溶液能夠有效測(cè)定益氣生血膠囊中的黃芪甲苷含量。

3.2 流動(dòng)相選擇 本次研究所采用的方法為反相高效液相色譜法，即由非極性固定相與極性流動(dòng)相所組成的色譜體系[14]，可避免對(duì)照品峰與雜質(zhì)峰在前期出現(xiàn)包峰現(xiàn)象，從而影響對(duì)圖譜的判斷；反相高效液相色譜法最常應(yīng)用的流動(dòng)相為乙腈與甲醇，最常應(yīng)用的固定相為十八烷基鍵合的硅膠；而查閱黃芪甲苷的紫外區(qū)吸收波長(zhǎng)可知，其吸收波長(zhǎng)較短，僅在200.8 nm條件下，故以乙腈作為流動(dòng)相效果更佳[15]；為增加黃芪甲苷的保留時(shí)長(zhǎng)，對(duì)流動(dòng)相內(nèi)加以適當(dāng)?shù)牧姿嵴{(diào)節(jié)總體pH，并降低乙腈占比，能夠使黃芪甲苷的峰型加寬，避免雜質(zhì)峰對(duì)黃芪甲苷峰的干擾，延長(zhǎng)了黃芪甲苷的出峰時(shí)間，且結(jié)合本次研究的圖譜可知，黃芪甲苷最終出峰處并無(wú)較大的雜質(zhì)峰，辨識(shí)度高，說(shuō)明在流動(dòng)相為乙腈-0.1磷酸溶液(30∶70)系統(tǒng)中，黃芪甲苷峰與雜質(zhì)峰分離效果較好。

3.3 結(jié)論 本次研究所選用的3個(gè)批號(hào)樣品，分別對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，其黃芪甲苷含量差異較小，在1.20～1.30 mg/mL區(qū)間內(nèi)浮動(dòng)，說(shuō)明該工藝提取技術(shù)在提高黃芪甲苷提取率、縮短提取時(shí)間、防止活性成分破壞等方面具有重要的作用，且該檢驗(yàn)方法提取率高，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，可選用并建立為該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。