陳蘇華，程振波，李直懋，張國燦，張 冉

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410006）

乙型肝炎病毒（HBV）感染是急、慢性肝炎的主要原因［1］。目前用于治療乙型肝炎的藥物有聚乙二醇化α干擾素（Peg-IFNα）與核苷類似物。但是，Peg-IFNα往往只在治療初期有效［2］，Peg-IFNα耐藥的分子機制尚不清楚。蛋白磷酸酶2Ac（PP2Ac）可以與細胞中的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（PRMT1）發(fā)生相互作用，從而導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子1（STAT1）的低甲基化，抑制Peg-IFNα誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)［3-6］。有研究表明，HBV的表面蛋白和X蛋白可以誘導(dǎo)PP2Ac的表達［5］。

本研究分別采用HBsAg特異性免疫球蛋白G（HBIG）和RNAi技術(shù)控制細胞內(nèi)HBsAg的水平，對HBsAg導(dǎo)致干擾素治療無效的機制進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)使用DMEM培養(yǎng)基（GIBCO）加10 %的胎牛血清（GIBCO）將HepG2.2.155細胞（上海細胞生物學(xué)研究所，HBV陽性并能完整復(fù)制）置于37 ℃、5%的CO2的條件下培養(yǎng)。以3×105/mL細胞密度接種六孔板。24 h后用Peg-IFNα和HBIG分別處理細胞，72 h后收集培養(yǎng)上清進行分析。

1.2 RNAi轉(zhuǎn)染前一天，將HepG2.2.15細胞以2×104個/cm2的密度接種在6孔板中，第二天細胞融合度約50%。對照組僅用siRNA緩沖液處理。按照試劑盒操作說明，使用無血清、無抗生素培養(yǎng)基將10μL Lip2000（Invitrogen）和 150 pmol siRNA 混合進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6h后，把培養(yǎng)基換成含10% FBS的DMEM。siRNA處理72 h后，收集上清液和細胞進行進一步分析。

抑制率= ［1-A值（實驗組）/ A值（陰性對照）］×100%。

1.3 免疫印跡分析（Western blot）使用冷藏后的PBS和0.1% EDTA收集細胞，PBS洗滌3次，再加入100μL pH 8.0的裂解緩沖液（1%NP-40，80 mM Tris，150 mM NaCl，10mM EDTA），充分混勻后 4℃放置 30 min。1200 g離心5 min去除細胞核。以總上樣量為10μg的蛋白在12%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，并轉(zhuǎn)移到0.45μm 的醋酸纖維薄膜，轉(zhuǎn)膜緩沖液為 25 mM Tris /HCl（pH 8.3），192 mM甘氨酸和20%甲醇。使用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h。隨后加入一抗和HRP標(biāo)記的二抗進行檢測。一抗分別是抗HBsAg的小鼠單克隆抗體（abcam）、抗PP2Ac、抗PRMT1、抗pSTAT1和抗β-actin（內(nèi)參）的兔單克隆抗體，1∶1000稀釋。二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG單克隆抗體，1：5000稀釋。選擇β-actin作為內(nèi)參蛋白，在QUANTITY ONE成像系統(tǒng)（Bio-Rad）下顯影。

1.4 ELISA根據(jù)雅培HBsAg ELISA試劑盒的說明書，檢測HepG2.2.15細胞上清液中分泌的HBsAg量。結(jié)果以吸光度值與cut-off值的比值表示，并計算出HBsAg分泌的百分比。

1.5 RNA提取和定量實時PCR（Q-PCR）嚴格按照Trizol試劑盒（Invitrogen）操作說明書，提取細胞總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）以起始模板量為0.5μg的RNA制備cDNA。實時熒光定量PCR使用 SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒（Takara）。擴增儀器為 Step One Plus（Applied Biosystems），擴增程序為 95℃30 s后接著 95℃ 5 s，60℃ 34 s，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s進行40個循環(huán)，做熔解曲線分析。HBsAg基因表達分析的引物 ：上游引物 5'-CTC ACA ATA CCG CAG AGTC-3'和下游引物5'-TAA ACT GAG CCA GGA GAAA-3'。PP2Ac的引物是 ：上游引物 5'-CAA TGG CCT CAC GTT GGT-3'和下游引物 5'-TCC ATG ATT GCA GCT TGG TT-3'。以 GAPDH RNA 作為內(nèi)對照。GAPDH的引物是：上游引物5'-TGACTTCAACAGCGA CACCCA-3'和下游引物5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCA AA-3'。結(jié)果以2-ΔCt表示 mRNA的相對表達水平［7］，實驗組和對照組之間的mRNA濃度差異以倍數(shù)表示，使用Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 HBIG對細胞內(nèi)HBsAg含量的影響為了分析HBIG對HBsAg分泌的影響，用不同濃度（1.0、0.5和0.25 mg/mL）的HBIG培養(yǎng)HepG2.2.15細胞，以沒有添加HBIG的細胞作為對照。培養(yǎng)72 h后，用免疫印跡檢測細胞內(nèi)HBsAg。我們發(fā)現(xiàn)用HBIG處理的細胞中HBsAg的表達都有不同程度增加；與對照組相比，用0.25、0.5、1.0 mg/mL HBIG培養(yǎng)的細胞中 HBsAg的分別增加2.24、3.22、5.20倍（圖1A）。為了進一步確定PP2Ac是否會隨HBsAg的變化而改變，我們還測定了PP2Ac表達量。在相同的細胞質(zhì)提取物中，我們通過免疫印跡發(fā)現(xiàn)，PP2Ac的表達量在使用0.25、0.5和1.0 mg/mL HBIG時，相比對照組分別增加2.13、2.20和3.22倍（圖1A）。然后，我們使用實時定量PCR分析了PP2Ac 的mRNA表達量。如圖1B所示，所有實驗組的PP2Ac mRNA都出現(xiàn)了不同程度的增加。由此表明，當(dāng)HBsAg水平升高時，PP2Ac出現(xiàn)表達增加。

圖1 用不同濃度的HBIG處理HepG2.2.15細胞72 h后 ：（A）Western blot檢測HepG2.2.15細胞中HBsAg和PP2Ac表達。（B）qRT-PCR檢測HepG2.2.15細胞中PP2Ac的mRNA水平。

2.2 HBsAg誘導(dǎo)PP2Ac表達為研究HBsAg是否影響Peg-IFNα作用通路，我們比較了不同劑量Peg-IFNα組PP2Ac表達水平（圖2A）。如圖所示，在用Peg-IFNα處理細胞后，PP2Ac的表達被抑制；且在Peg-IFNα濃度為5000 IU/mL時，PP2Ac的表達量最低，可用于后續(xù)實驗。

然后，我們將細胞在不同濃度HBIG（1、0.5、0.25 mg/mL）培養(yǎng) 72 h，再加入Peg-IFNα（5000 IU/mL）中培養(yǎng)6 h。通過免疫印跡和實時定量PCR分析了PP2Ac的mRNA以及蛋白的表達水平，以確定在Peg-IFNα存在的情況下，HBsAg是否會干擾PP2Ac的表達。結(jié)果顯示，在不同濃度 HBIG（1、0.5、0.25 mg/mL）HBIG 處理的細胞中，PP2Ac的蛋白表達量時分別為對照組的3.02、2.93、1.34倍（圖2B）；mRNA的水平也高于對照組（圖2C）。同時，我們還采用免疫印跡分析PRMT1的表達。與對照細胞相比，我們發(fā)現(xiàn)在具有高濃度的PP2Ac細胞中，PRMT1明顯被抑制（圖2B）。

結(jié)果表明，HBsAg在Peg-IFNα的存在下增加PP2Ac的表達，并抑制PRMT1在細胞中的表達。

圖2 （A）不同濃度的IFN-α處理HepG2.2.15細胞6 h后，Western blot分析PP2Ac的表達。（B）用5000 IU/ml的IFN-α刺激細胞6 h后，以不同濃度HBIG處理HepG2.2.15細胞72 h，Western blot檢測PP2Ac和PRMT1的表達水平。（C）處理方法同（B），qRT-PCR檢測細胞中PP2Ac的mRNA水平。

2.3 RNAi下調(diào)HBsAg的水平我們用三種不同的siRNA（表1）轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞，并使用一種沉默siRNA作為陰性對照。在用siRNA處理后，分別在24 h、48 h和72 h 收集上清液。經(jīng) ELISA（圖 3A）、Western blot（圖3B）檢測發(fā)現(xiàn)，在siRNA轉(zhuǎn)染的細胞中HBsAg表達水平被顯著抑制。與沉默 siRNA轉(zhuǎn)染細胞相比，三種siRNA對HBsAg的抑制率分別為60.2%、27.8%和57.0%。說明三種siRNA均可有效地降低了HBsAg基因的表達。另外我們同時分析了用siRNA處理72 h后細胞中PP2Ac的表達水平，發(fā)現(xiàn)PP2Ac表達水平也顯著降低（圖3B）。與沉默siRNA轉(zhuǎn)染的細胞相比，三種siRNA對PP2Ac的抑制率分別為44.1%、29.3%和37.0%。實時定量PCR結(jié)果（圖3C）也表明，隨著HBsAg mRNA表達的降低，PP2Ac mRNA的水平隨之降低。

表1 RNAi中使用的引物

圖3 （A）用三種不同的siRNA或沉默siRNA轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞。在每個周期結(jié)束時，即在三個時間點，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法測試上清液。（B）Western blot分析檢測siRNA轉(zhuǎn)染72 h后細胞中HBsAg和PP2Ac蛋白表達水平。（C）轉(zhuǎn)染的72 h后qRT-PCR檢測細胞中HBsAg和PP2Ac的mRNA水平。

3 討論

PP2A是幾乎在所有細胞中都表達的一種異源三聚體絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，由36 kD催化C亞基（PP2Ac）、65 kD結(jié)構(gòu)性A亞基和可變調(diào)控B亞基組成。PP2Ac在細胞周期調(diào)節(jié)、形態(tài)、發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡和多種信號通路的調(diào)節(jié)等細胞進程中發(fā)揮著效應(yīng)［8］。PP2Ac在HCV轉(zhuǎn)基因小鼠和丙型肝炎患者的肝細胞都有過表達［4］。另外有研究證明HBV的表面蛋白和X蛋白可以誘導(dǎo)PP2Ac的表達［5］。

近年，有相關(guān)研究對病毒逃逸干擾素作用的分子機制做了探討，PP2Ac會通過Jak-STAT途徑影響Peg-IFNα的敏感性［3］。這些研究表明，PP2Ac與PRMT1在細胞中發(fā)生相互作用導(dǎo)致STAT1低甲基化和Peg-IFNα誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)受到抑制，從而導(dǎo)致HBV患者干擾素治療無效［4-6］。

體外實驗表明，HBIG可以被內(nèi)吞入肝細胞系，與HBsAg發(fā)生相互作用，抑制細胞分泌HBsAg和HBV病毒顆粒［9，10］。RNAi是 siRNA 引起 mRNA 特異性降解的過程。利用RNAi技術(shù)可以顯著且特異性地抑制HBsAg基因的表達［11，12］。因此，我們使用 HBIG 和基因沉默來調(diào)節(jié)體外HBsAg的水平。

在本研究中，我們使用穩(wěn)定表達HBV基因組的HepG2.2.15細胞來分析HBsAg對PP2Ac的作用。結(jié)果顯示，無論Peg-IFNα是否存在，隨著HBsAg的水平升高，PP2Ac的表達均會增加（圖1和圖2）。表明HBsAg增加可以促進PP2Ac的表達，且Peg-IFNα不能影響HBsAg對PP2Ac的作用。隨后我們發(fā)現(xiàn)PP2Ac表達增加可以抑制PRMT1的表達（圖2B）。PRMT1是在所有細胞中表達的重要酶，并參與許多蛋白質(zhì)的精氨酸甲基化。PRMT1通過改變STAT1的精氨酸甲基化程度，調(diào)節(jié)Peg-IFNα誘導(dǎo)的靶基因轉(zhuǎn)錄［13］。當(dāng)HBsAg的表達被RNAi抑制時，PP2Ac基因的表達也被抑制（圖3）。我們的結(jié)果表明HBsAg可以增強PP2Ac的表達，而PP2Ac可以直接與PRMT1相互作用，進而抑制Peg-IFNα的敏感性。

在HBV的患者血清中，除了感染性顆粒外，還有大量游離的HBsAg以SVP的形式存在［14］。SVP可能會中和宿主產(chǎn)生的抗體，從而增加病毒感染性［15，16］；SVP也有助于產(chǎn)生免疫耐受狀態(tài)，導(dǎo)致病毒的持續(xù)感染［17］。因血清中HBsAg的含量與細胞內(nèi)HBsAg成正比［18］。血清中存在高濃度的HBsAg預(yù)示著患者對干擾素治療的敏感性低。與以前研究相比，本研究讓我們對HBsAg功能有了新的認識，然而，HBsAg與IFN相互作用的潛在分子機制需要進一步研究。

總之，我們使用Western blot，qRT-PCR和ELISA確定了HBsAg對PP2Ac表達的影響；探究了HBsAg抑制干擾素作用的初步分子機制：PP2Ac的上調(diào)會抑制PRMT1的活性，最后影響干擾素治療的敏感性。HBsAg可以影響Peg-IFNα的敏感性，可作為治療慢性乙型肝炎患者潛在靶標(biāo)，為慢性乙肝感染患者的治療方法提供新思路。