曾穗敏，劉海林，鄭 哲，歐彥汝，馬 駿，曾詩(shī)語(yǔ)，張曉莉，Hocher Berthold，李 健

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013）

焦慮癥和抑郁癥是一種困擾人們生活健康，社會(huì)危害的疾病，全球焦慮癥患者約有2.6億，全球抑郁癥患者約有3.1億［1］。目前，焦慮癥和抑郁癥的病因并不非常清楚，但可能是生物、心理和社會(huì)環(huán)境等諸多方面因素均參與了焦慮癥和抑郁癥的發(fā)病過(guò)程。因此，尋找兩種疾病發(fā)病原因，并從源頭防治此病具有重要意義。

由“成人疾病的胎兒起源”假說(shuō)發(fā)展而來(lái)的健康與疾病的發(fā)育起源（DOHaD）學(xué)說(shuō)在全世界已被成千上萬(wàn)位科學(xué)家所認(rèn)可［2，3］，學(xué)說(shuō)認(rèn)為配子發(fā)育時(shí)期，宮內(nèi)與兒童早期的經(jīng)歷的營(yíng)養(yǎng)、心理、社會(huì)應(yīng)激藥物等方面的不良因素，會(huì)對(duì)人的終生的健康和疾病發(fā)生影響，會(huì)導(dǎo)致成年以后患病的風(fēng)險(xiǎn)增強(qiáng)。目前母親的飲食對(duì)后代的影響已被廣泛研究，數(shù)據(jù)顯示母親肥胖可以影響后代健康，使他們更容易患肥胖、糖尿病和高血壓［4-6］。從當(dāng)前的研究來(lái)看，母系圍產(chǎn)期不良營(yíng)養(yǎng)狀況會(huì)會(huì)對(duì)后代神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響，可以導(dǎo)致一些精神疾病的發(fā)生，如焦慮和抑郁等［7-9］。隨著研究的發(fā)展，人們也開(kāi)始關(guān)注父系編程對(duì)后代神經(jīng)內(nèi)分泌功能的影響。截至目前為止，父系DOHaD學(xué)說(shuō)研究中，父系編程對(duì)子代焦慮和抑郁的影響的研究還很少，尤其是缺乏模擬人類(lèi)不良飲食狀態(tài)的高鹽高脂高糖飲食（高復(fù)合飲食）對(duì)后代的研究。本研究采用高復(fù)合飲食給予親代（F0）雄性 SD 大鼠交配前暴露，且子一代（F1）雄鼠進(jìn)一步給予高復(fù)合飲食二次暴露，來(lái)觀察對(duì)子二代（F2）大鼠焦慮和抑郁樣行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用SD雄性大鼠30只（4周齡，體質(zhì)量100～140克）和SD雌性大鼠45只購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。SD大鼠飼養(yǎng)于湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房，5只一籠，保持12小時(shí)光照，12小時(shí)黑暗，標(biāo)準(zhǔn)溫度20℃～25℃，相對(duì)濕度50%～70%，并且水和食物自由攝取。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的進(jìn)行都得到了湖南師范大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2 飼料對(duì)照飲食和高復(fù)合飲食飼料均由江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司提供，普通飲食由動(dòng)物房常規(guī)提供，三種飼料營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)Li等人的文獻(xiàn)［10］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立與分組親代（F0）雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，隨機(jī)分為對(duì)照飲食組（CD，n=15）和高復(fù)合飲食組（HD，n=15）。F0雄性大鼠交配前高復(fù)合飲食飼料喂養(yǎng)9周后與對(duì)照飲食的雌鼠交配產(chǎn)生F1。F1給予對(duì)照飲食15周，然后分別從CD組和HD組的F1中隨機(jī)取雄鼠2只，給予對(duì)照飲食或高復(fù)合飲食二次暴露9周，在第24周時(shí)F1雄鼠與CD組的F1代雌鼠交配產(chǎn)生F2，F(xiàn)2大鼠均給予普通飼料喂養(yǎng)。動(dòng)物模型的建立具體參照Z(yǔ)hang等人的文獻(xiàn)［11］。F0雄性大鼠隨機(jī)分為兩個(gè)組：（1）對(duì)照飲食組（CD，n=15）；（2）高鹽高脂高糖飲食組（HD，n=15）。F1代分為兩組：（1）F1CD組：F0雄鼠喂養(yǎng)對(duì)照飲食的子一代；（2）F1HD：F0雄鼠喂養(yǎng)高復(fù)合飲食的子一代。F2代分為4組：（1）F0CD+F1CD 組：F0和F1雄鼠均喂養(yǎng)對(duì)照飲食的子二代；（2）F0CD+F1HD 組：F0親代雄鼠喂養(yǎng)對(duì)照飲食和F1代雄鼠喂養(yǎng)高復(fù)合飲食的子二代；（3）F0HD+F1CD 組：F0親代雄鼠喂養(yǎng)高復(fù)合飲食和F1代雄鼠喂養(yǎng)對(duì)照飲食的子二代；（4）F0HD+F1HD 組：F0和F1親代雄鼠均喂養(yǎng)高復(fù)合飲食的子二代。

1.2.2 體重指標(biāo)檢測(cè)定期觀察大鼠生長(zhǎng)狀態(tài)、毛色、食欲和行為狀態(tài)等，每周記錄大鼠進(jìn)食量。F2代大鼠分別在第12、15、18、22和25周用電子天平測(cè)量體重。

1.2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分別在F2代大鼠第12周和23周進(jìn)行。使用規(guī)格為40×100×100cm的實(shí)驗(yàn)箱，底面平均分為25個(gè)4 cm×4 cm小方格，專(zhuān)門(mén)的測(cè)試軟件記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前5天開(kāi)始輕輕撫摸大鼠，每只大鼠每天撫摸5min，讓其熟悉實(shí)驗(yàn)者，減少人為畏懼因素。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前兩小時(shí)將大鼠搬入實(shí)驗(yàn)房間適應(yīng)，調(diào)整好相關(guān)儀器。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為5分鐘，記錄5分鐘內(nèi)中央停留時(shí)間。

1.2.4 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)分別在F2代大鼠第12周和23周進(jìn)行。高架十字迷宮包括兩個(gè)開(kāi)臂，兩個(gè)閉臂。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前兩小時(shí)將大鼠搬入實(shí)驗(yàn)房間適應(yīng)，調(diào)整好相關(guān)儀器。使用高架迷宮的軟件記錄大鼠實(shí)驗(yàn)期間（通常為5min）進(jìn)入開(kāi)臂和閉臂次數(shù)及在兩臂的停留時(shí)間等檢測(cè)指標(biāo)。

1.2.5 新奇環(huán)境抑制攝食實(shí)驗(yàn)分別在F2代大鼠第12周和23周進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)裝置為頂部開(kāi)放的木質(zhì)箱子，底部劃分為大小均勻的15 cm×15 cm的方格。大鼠禁食24 h 后，保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境安靜，然后將大鼠放入箱子的角落，中間擺放一顆食物，攝像頭記錄10 min，觀察大鼠從放進(jìn)盒子里到準(zhǔn)備進(jìn)食的潛伏期，然后將其放回鼠籠內(nèi)。

1.2.6 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)在F2代大鼠第25周進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前兩小時(shí)，將大鼠放入實(shí)驗(yàn)房間適應(yīng)環(huán)境。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠放入高70cm，直徑40cm的圓柱形玻璃缸中，水溫控制在23～25℃，水深45cm。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)包括兩部分：第一天進(jìn)行15 min 的適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，取出后擦干，放置回籠中。24 h之后，再次將大鼠置于容器中進(jìn)行5 min 測(cè)試實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠在此期間的累積不動(dòng)時(shí)間。不動(dòng)時(shí)間為大鼠在水中停止掙扎、呈漂浮狀態(tài)，或者僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部漂浮于水面之上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用 SPSS 22. 0 軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（Independent－samples test），多組間比較采用單方向方差分析（One-way ANOVA），若方差齊則采用LSD（Least significant difference test）法，若方差不齊，則采用多重比較Dunnett’sT3法檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雄鼠交配前高復(fù)合飲食對(duì)F2體重改變的影響F2雌鼠中，與F0CD+F1CD組相比，在第18周F0HD+F1HD組大鼠的體重明顯升高（P＜0.05），在第22周F0HD+F1CD組和F0HD+F1HD組大鼠的體重明顯升高（P＜0.05）（圖1A）。F2雄鼠中，與F0CD+F1CD組相比，F(xiàn)0HD+F1HD組大鼠的體重沒(méi)有明顯變化（圖1B）。表明祖父和父親交配前高復(fù)合飲食會(huì)導(dǎo)致子二代大鼠體重增加，并以雌鼠體重增加更為明顯。

圖1 雄鼠交配前高復(fù)合飲食對(duì)子二代體重的影響

2.2 雄鼠交配前高復(fù)合飲食對(duì)F2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)行為學(xué)的影響在第12周曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)2代雌鼠和雄鼠四組之間中心區(qū)停留時(shí)間無(wú)明顯差異（圖2A，B）。但是在第23周曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與F0CD+F1CD組相比，F(xiàn)0CD+F1HD組，F(xiàn)0HD+F1CD組和F0HD+F1HD組雌鼠和雄鼠的中心區(qū)停留時(shí)間均顯著降低（雌鼠P＜0.01，雄鼠P＜0.05）（圖2C，D）。表明祖父和父親交配前高復(fù)合飲食導(dǎo)致F2大鼠出現(xiàn)焦慮樣行為，并且雌鼠的焦慮樣行為更明顯。

圖2 子二代大鼠12周和23周各組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.3 雄鼠交配前高復(fù)合飲食對(duì)F2高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)行為學(xué)的影響在第12周高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)0CD+F1HD組和F0HD+F1HD組雌鼠開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)相比于F0CD+F1CD組明顯降低（圖2-3A），并且F0CD+F1HD組，F(xiàn)0HD+F1CD組和F0HD+F1HD組雌鼠在開(kāi)放臂停留時(shí)間也明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3C）。F0HD+F1CD組雄鼠在開(kāi)放臂停留時(shí)間明顯降低（P＜0.05）（圖3D）。在第23周高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)0CD+F1HD組和F0HD+F1HD組雌鼠和雄鼠開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)明顯低于F0CD+F1CD組（P＜0.05）（圖4A，B），F(xiàn)0HD+F1HD組雌鼠開(kāi)放臂停留時(shí)間明顯低于F0CD+F1CD組（P＜0.05）（圖4C）。表明祖父和父親交配前高復(fù)合飲食導(dǎo)致F2大鼠出現(xiàn)焦慮樣行為。

2.4 雄鼠交配前高復(fù)合飲食對(duì)F2新奇環(huán)境抑制攝食行為學(xué)的影響在第12周新奇環(huán)境抑制攝食中，F(xiàn)2代雌鼠和雄鼠四組之間攝食潛伏期無(wú)明顯差異（圖5A，B）。但是在第23周新奇環(huán)境抑制攝食中發(fā)現(xiàn)，雌鼠F0CD+F1HD組和雄鼠F0HD+F1CD組的攝食潛伏期顯著高于F0CD+F1CD組（P＜0.05）（圖5C，D）。表明祖父和父親交配前高復(fù)合飲食導(dǎo)致F2大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。

2.5 雄鼠交配前高復(fù)合飲食對(duì)F2強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)行為學(xué)的影響在第25周強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)0HD+F1HD組雌鼠不動(dòng)時(shí)間明顯低于F0CD+F1CD組（P＜0.05）（圖6A）。F2代雄鼠四組之間沒(méi)有觀察到不動(dòng)時(shí)間有明顯差異（圖6B）。表明祖父和父親交配前高復(fù)合飲食兩次暴露產(chǎn)生的F2雌鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，而F2雄鼠未出現(xiàn)抑郁樣行為。

圖3 子二代大鼠12周各組高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

圖4 子二代大鼠23周各組高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

3 討論

圖5 子二代大鼠12周和23周各組新奇環(huán)境抑制攝食實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

圖6子二代大鼠25周各組強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

DOHaD學(xué)說(shuō)認(rèn)為環(huán)境等暴露因素導(dǎo)致生命早期表型的改變，將程序化成年期罹患疾病的風(fēng)險(xiǎn)性。絕大部分研究關(guān)注于母系圍產(chǎn)期不良暴露對(duì)后代的影響，而越來(lái)越多的臨床證據(jù)表明父系暴露于不良因素也可能通過(guò)胚胎程序化對(duì)子代疾病起作用，并將增加子代罹患成人疾病的風(fēng)險(xiǎn)［12，13］。目前父系的不良飲食狀況會(huì)對(duì)后代行為有何影響，目前還不清楚。我們首次采用高復(fù)合飲食給予 F0雄性 SD 大鼠交配前暴露，且 F1雄鼠進(jìn)一步給予高復(fù)合飲食二次暴露，來(lái)觀察對(duì)F2大鼠焦慮和抑郁樣行為的影響。我們首次發(fā)現(xiàn)雄鼠交配前高復(fù)合飲食兩次暴露會(huì)導(dǎo)致F2大鼠體重增加，以及產(chǎn)生焦慮和抑郁樣行為，并且具有性別差異性，以雌鼠的體重增加和焦慮和抑郁樣行為增加更為明顯。

Ng等人報(bào)道，與同窩對(duì)照大鼠相比，即使喂食正常脂肪飲食，父親在交配前喂養(yǎng)高脂飲食的第11周的F1后代體重更高，脂肪組織積累更多［14］。本研究發(fā)現(xiàn)F2大鼠體重檢測(cè)結(jié)果顯示祖父和父親交配前高復(fù)合飲食會(huì)導(dǎo)致F2大鼠體重增加，以雌鼠體重增加更為明顯。已有研究表明，多數(shù)的焦慮癥患者常常合并有抑郁障礙，稱(chēng)為共病現(xiàn)象，常見(jiàn)的共病有抑郁障礙、驚恐障礙、強(qiáng)迫障礙等，共病造成焦慮癥的診斷和治療難［15］。我們通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和新奇環(huán)境抑制攝食實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察父系交配前高復(fù)合飲食兩次暴露所產(chǎn)生的F2的焦慮和抑郁樣行為變化。研究結(jié)果顯示祖父和父親交配前高復(fù)合飲食兩次暴露可導(dǎo)致子二代大鼠焦慮和抑郁樣行為水平增加，并以雌鼠的焦慮和抑郁樣行為更明顯。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，體重增加是精神疾病高發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)因素，包括焦慮、抑郁和注意力缺陷多動(dòng)障礙等［16］。本研究發(fā)現(xiàn)祖父和父親交配前高復(fù)合飲食兩次暴露會(huì)導(dǎo)致F2大鼠體重增加，以及產(chǎn)生焦慮和抑郁樣行為。

綜上，父親不良因素暴露將增加其子代在生活中的神經(jīng)內(nèi)分泌疾病易感性，但是其具體機(jī)制有待進(jìn)一步挖掘。在其他關(guān)于父系DOHaD學(xué)說(shuō)的機(jī)制研究中，許多學(xué)者認(rèn)為表觀遺傳學(xué)改變是父系程序化子代疾病的重要機(jī)制，尤其是精子表觀遺傳學(xué)的改變。Chen Q等研究組通過(guò)將高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的精子總RNA 注射到正常的受精卵中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其出生的子代小鼠在正常飲食下，也會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似于父代肥胖小鼠的糖代謝紊亂，這提示肥胖小鼠精子RNA 中攜帶有傳遞父代獲得性性狀的表觀遺傳信息，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在父代肥胖小鼠模型中，精子tsRNAs的表達(dá)譜以及RNA修飾譜均發(fā)生了顯著的變化，然后通過(guò)分離肥胖小鼠精子中的 tsRNAs（30-40 nt RNA）并注射到正常受精卵內(nèi)，發(fā)現(xiàn)tsRNAs能像總RNA 一樣誘導(dǎo)子代代謝紊亂，而注射其他片段的精子 RNA（15-25 nt或 ＞ 40 nt RNA）則不能引發(fā)代謝紊亂［17，18］。Ali等人研究發(fā)現(xiàn)，在繁殖前將雄性小鼠暴露于6周的慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激下，其后代均表現(xiàn)出顯著地下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（HAP）軸反映不足，進(jìn)一步研究精子表觀遺傳機(jī)制發(fā)現(xiàn)，父系的精子中microRNA（miR）含量顯著增加，分別是miR-193-5p、miR-204、miR-29c、miR-30a、miR-30c、miR-32、miR-375、miR-532-3p和miR-698，再將這9個(gè)特異miR的配子經(jīng)顯微注射繁殖后代，后代顯著地再現(xiàn)了應(yīng)激失調(diào)表型［19，20］。雄性C57BL/6小鼠在青春期經(jīng)歷兩周的慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激后會(huì)增加F1和F2的焦慮和抑郁樣行為，這種代際或跨代遺傳的產(chǎn)生的后代杏仁核中會(huì)產(chǎn)生更為顯著的差異基因表達(dá)［21］。成年雄性大鼠喂養(yǎng)甲基化供體耗盡或?qū)φ诊嬍?周后與正常雌鼠交配，其甲基化供體耗盡飲食組的F1代表現(xiàn)出焦慮和抑郁樣行為的增加［22］。

結(jié)合既往研究，我們推測(cè)本研究中祖父和父親交配前高復(fù)合飲食兩次暴露導(dǎo)致F2焦慮和抑郁樣行為的增加可能是通過(guò)精子表觀遺傳學(xué)的改變發(fā)生的。此外，單胺遞質(zhì)假說(shuō)、HPA軸異常和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等學(xué)說(shuō)均揭示了焦慮癥和抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，遺憾的是我們未對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌中與焦慮癥和抑郁癥發(fā)病機(jī)制學(xué)說(shuō)相關(guān)的分子標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。下一步，我們將從表觀遺傳機(jī)制和分子機(jī)制方面研究父系交配前高復(fù)合飲食暴露導(dǎo)致后代出現(xiàn)焦慮和抑郁樣行為的原因，從而闡明父系編程在后代出現(xiàn)焦慮和抑郁樣行為的具體機(jī)制。