張莉，占超

1黃石市婦幼保健院婦女保健科，湖北 黃石 435000

2黃石市中醫(yī)醫(yī)院康復(fù)科，湖北 黃石 4350000

宮頸癌是一種婦科最常見的惡性腫瘤之一，中國家發(fā)病率僅次于乳腺癌，中國發(fā)病率位居世界前列且呈年輕化發(fā)展趨勢[1]，嚴(yán)重影響女性的生命健康。現(xiàn)已證實(shí)，人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是多種宮頸疾病的主要危險因素，可能通過與宿主DNA結(jié)合而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而導(dǎo)致宮頸病變甚至誘發(fā)宮頸癌[2]。隨著醫(yī)療科研水平的提高，研究證實(shí)，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫應(yīng)答密切相關(guān)[3]。人類白細(xì)胞化抗原（human lekocyte antigen，HLA）可識別外來抗原，在機(jī)體啟動免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其中HLA-E和HLA-G作為非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子，在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，HLA-E和HLA-G可抑制多種免疫細(xì)胞的活性，使腫瘤逃避免疫監(jiān)視，在腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[5]。本研究采用免疫組化法分別檢測HLA-E、HLA-G在宮頸癌患者病理標(biāo)本中的表達(dá)并檢測HPV感染狀態(tài)，探討二者與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系，并進(jìn)一步分析其與HPV感染情況的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2018年2月黃石市婦幼保健院及黃石市中醫(yī)醫(yī)院收治的宮頸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為宮頸癌；術(shù)前均未接受放化療等抗腫瘤治療；無其他腫瘤及免疫性疾病等病史；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：月經(jīng)期、妊娠期及哺乳期婦女；既往3天內(nèi)曾有性生活史、婦科檢査、陰道沖洗或陰道內(nèi)用藥。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入150例早期宮頸癌患者，年齡39～79歲，平均（46.26±12.23）歲，＜45歲60例，≥45歲90例；依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰa期76例，Ⅰb期74例；分化程度：高分化52例，中分化58例，低分化40例；腫瘤直徑：＜1 cm 70例，≥1 cm 80例。同期選取上皮內(nèi)瘤病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者和慢性宮頸炎患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：篩查前無宮頸癌病史；受檢時處于非月經(jīng)期；近3個月內(nèi)無性激素使用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并急性生殖道炎癥；既往存在宮頸錐切術(shù)或子宮切除術(shù)史；妊娠期女性。本研究共納入120例CIN患者和154例慢性宮頸炎患者。CIN組患者年齡32～75歲，平均（46.98±11.96）歲；CIN分級：CINⅠ38例，CINⅡ40例，CINⅢ46例。慢性宮頸炎組患者年齡30～72歲，平均（48.68±10.76）歲。取150例早期宮頸癌患者的宮頸癌組織，120例CIN患者的CIN組織，154例慢性宮頸炎患者的正常宮頸組織。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑 人宮頸癌細(xì)胞株HeLa（HPV16+）、C33a（HPV18+）、Cask（iHPV-）均購自海德創(chuàng)業(yè)（北京）生物科技有限公司，HPVl6 E6/E7特異性siRNA序列及陰性對照（negative control，NC）序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)完成，E6及NC由上海吉碼制藥技術(shù)有限公司代為合成，鼠抗人HLA-E單克隆抗體、鼠抗人HLA-G單克隆抗體均購自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司，HPV檢測試劑盒、通用型二抗試劑盒均購自美國Abcam公司，免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白質(zhì)印跡（Western blot）試劑盒均購自美國sigma公司。

1.2.2 免疫組化法檢測HLA-E、HLA-G蛋白的表達(dá)情況 將收集的組織樣本固定包埋并切片，二甲苯和梯度乙醇脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)，充分暴露抗原決定簇。3%的雙氧水室溫下浸泡10 min，封閉，分別加入稀釋好的一抗4℃孵育過夜，次日沖洗干凈，分別加入適量生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min，清洗。加入適量DAB作用2～5 min，去離子水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染1.5～2.0 min，清洗后梯度乙醇脫水，二甲苯浸泡，干燥后用中性樹膠封片，鏡檢觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果判定：由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師對病理切片進(jìn)行盲評，光學(xué)顯微鏡下觀察制備好的切片，HLA-E、HLA-G蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色染色為陽性。每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野，每個視野隨機(jī)計(jì)數(shù)200個細(xì)胞，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分。染色強(qiáng)度評分：無著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。陽性細(xì)胞所占比例評分：無陽性細(xì)胞計(jì)0分，陽性細(xì)胞所占比例＜25%計(jì)1分，陽性細(xì)胞所占比例25%～50%計(jì)2分，陽性細(xì)胞所占比例51%～75%計(jì)3分，陽性細(xì)胞所占比例＞75%計(jì)4分。將染色強(qiáng)度評分和陽性細(xì)胞所占比例評分相加，≥3分為陽性，＜3分為陰性。

1.2.3 HPV 檢測及判定標(biāo)準(zhǔn) 采用一次性宮頸脫落細(xì)胞取樣器，在宮頸外口黏膜處取樣并置于無菌取樣管中，30 min內(nèi)使用HPV檢測試劑盒對樣品進(jìn)行檢測，以標(biāo)本中HPV的表達(dá)值相對光單位/陽性標(biāo)準(zhǔn)品閾值（relative light units/cut off，RLU/CO）作為病毒負(fù)荷量，RLU/CO＜1判定為陰性，RLU/CO≥1為陽性，且陽性分為 1～100、101～1000和＞1000共3個病毒負(fù)荷量級別。

1.2.4 Western blot法檢測HLA-E、HLA-G蛋白的相對表達(dá)量 將人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、轉(zhuǎn)染后48 h的HeLa-siE6和HeLa-NC細(xì)胞株，加入適量的放射免疫沉淀（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液裂解30 min，4℃情況下12 000 r/min離心10 min，收集上清，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液（loading buffer）混合，100℃水域變性5 min，然后加入至制備好的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠（5%濃縮膠，10%分離膠）上樣孔中，每孔25 μl，調(diào)整濃縮膠電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結(jié)束后取出凝膠，4℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜2 h，加入轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、SMAD一抗，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，37℃孕育2 h后加入電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯影，采用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 調(diào)整人宮頸癌細(xì)胞株HeLa濃度至1×106/ml，取2 ml接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，采用Lipofectamine 2000將濃度均為100 nmol/L的siE6和NC轉(zhuǎn)染至人宮頸癌細(xì)胞株HeLa，得到HeLa-siE6及HeLa-NC細(xì)胞株，以未處理的HeLa細(xì)胞作為空白對照。

1.2.6 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測E6mRNA 的相對表達(dá)量 將人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、轉(zhuǎn)染后48 h的HeLa-siE6和HeLa-NC細(xì)胞株，加入1 ml Ezol裂解液，混勻。12 000 r/min離心10 min，去除上清液，加入Trizol與三氯甲烷震蕩混勻，12 000 r/min離心10 min，加入異丙醇，用移液器吹打均勻，12 000 r/min離心后，棄去上層清液，留下層絮狀沉淀，采用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Premix ExTaq說明書配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct計(jì)算E6mRNA的相對表達(dá)量。每個樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。U6上游引物：5'-CCTGAGCAGGAACAGCTTGA-3'，下游引物：5'-CGTACGTAGTCGAACCGAGA-3'；E6上游引物：5'-CCATATCGCTGGATGACGAT-3'，下游引物：5'-GTG CAGGGTCCGAGGT-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LDS-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HLA-E、HLA-G 蛋白陽性表達(dá)率的比較

隨病變程度的加重，HLA-E、HLA-G蛋白的陽性表達(dá)率均逐漸升高，其中宮頸癌組織中HLA-E、HLA-G蛋白的陽性表達(dá)率均高于CIN組織和慢性宮頸炎組織，CIN組織中HLA-E、HLA-G蛋白的陽性表達(dá)率均高于慢性宮頸炎組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同組織中HLA-E、HLA-G蛋白陽性表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 HPV感染和病毒負(fù)荷量的比較

隨病變程度的加重HPV陽性率均逐漸升高，其中宮頸癌組織中HPV陽性率為89.33%（134/150），高于CIN組織和慢性宮頸炎組織的69.17%（83/120）和6.49%（10/154），CIN組織中HPV陽性率高于慢性宮頸炎組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同HPV病毒負(fù)荷量隨著病變程度的升高而增加（表2）。

表2 不同組織中HPV病毒負(fù)荷量

2.3 HLA-E、HLA-G 蛋白的表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，HLA-E和HLA-G蛋白的表達(dá)與分化程度、CIN分級、TNM分期和HPV感染均呈正相關(guān)，與年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無相關(guān)性，且HLA-E的表達(dá)與HLA-G呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.745，P=0.021）。（表3）

表3 HLA-E、HLA-G蛋白的表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性分析

2.4 不同HPV 感染狀態(tài)宮頸癌細(xì)胞中HLA-E、HLA-G 蛋白相對表達(dá)量的比較

Western blott法檢測不同HPV感染狀態(tài)的宮頸癌細(xì)胞中HLA-E、HLA-G的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，人宮頸癌Caski細(xì)胞中HLA-E、HLA-G的相對表達(dá)量均低于HeLa、C33a細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而人宮頸癌HeLa、C33a細(xì)胞中HLA-E、HLA-G的相對表達(dá)量的比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表4）

表4 不同HPV感染狀態(tài)宮頸癌細(xì)胞中HLA-E、HLA-G蛋白的相對表達(dá)量的比較（±s）

表4 不同HPV感染狀態(tài)宮頸癌細(xì)胞中HLA-E、HLA-G蛋白的相對表達(dá)量的比較（±s）

注：a與人宮頸癌HeLa細(xì)胞比較，P＜0.05；b與人宮頸癌C33a細(xì)胞比較，P＜0.05

細(xì)胞H e L a C 3 3 a C a s k i F值P值0.9 8±0.1 4 1.0 6±0.1 1 0.4 1±0.1 0 a b 1 5.6 2 3 0.0 0 0 1.0 2±0.0 8 1.0 4±0.0 9 0.5 2±0.0 8 a b 9.2 4 8 0.0 0 0 H L A-E蛋白H L A-G蛋白

2.5 不同人宮頸癌HeLa細(xì)胞中E6mRNA相對表達(dá)量的比較

HeLa-siE6細(xì)胞中E6mRNA的相對表達(dá)量為（0.28±0.02），明顯低于HeLa細(xì)胞的（0.95±0.09）和HeLa-NC細(xì)胞的（1.04±0.04），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.801、41.627，P＜0.01）。

2.6 沉默E6基因表達(dá)后不同HeLa細(xì)胞中HLAE、HLA-G 蛋白相對表達(dá)量的比較

人宮頸癌HeLa-siE6細(xì)胞中HLA-E、HLA-G蛋白的相對表達(dá)量，均明顯低于HeLa和HeLa-NC細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但人宮頸癌HeLa、HeLa-NC細(xì)胞中的HLA-E、HLA-G蛋白的相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表5）

表5 不同HeLa細(xì)胞中HLA-E、HLA-G蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

表5 不同HeLa細(xì)胞中HLA-E、HLA-G蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

注：a與人宮頸癌HeLa細(xì)胞相比，P＜0.05；b與人宮頸癌HeLa-NC細(xì)胞相比，P＜0.05

細(xì)胞H e L a H e L a-N C H e L a-s i E 6 F值P值0.9 8±0.0 4 0.1 0±0.0 7 0.4 8±0.0 5 a b 1 1.6 5 2 0.0 0 0 0.0 9 7±0.0 3 1.0 2±0.1 2 0.5 0±0.0 6 a b 1 0.8 4 4 0.0 0 0 H L A-E蛋白H L A-G蛋白

3 討論

宮頸癌是導(dǎo)致女性病死的第二大惡性腫瘤，流行病學(xué)分析報告顯示，近年來，宮頸癌呈現(xiàn)高發(fā)且年輕化趨勢，宮頸癌的發(fā)展是從宮頸良性病變進(jìn)展為宮頸上皮內(nèi)瘤病變，再進(jìn)展為惡性癌變，是一個動態(tài)并連續(xù)的過程[6]。因此，早期篩查并采取及時有效的控制措施進(jìn)行干預(yù)是防止宮頸病變持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，HLA-G、HLA-E對免疫系統(tǒng)的影響已在多種腫瘤的得到證實(shí)，二者對樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞具有相似的不良反應(yīng)，可通過與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合而發(fā)揮抑制作用；HLA-G、HLA-E還存在協(xié)同作用，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[7]。此外，HLA-G、HLA-E還可與某些細(xì)胞因子結(jié)合，使免疫細(xì)胞對腫瘤特異性抗原無應(yīng)答反應(yīng)。Cordeiro等[8]研究發(fā)現(xiàn)，HLA-G在宮頸病變CINⅢ組織中異常高表達(dá)，患者發(fā)生宮頸癌變的風(fēng)險明顯增加。Kirana等[9]的研究結(jié)果顯示，HLA-G高表達(dá)宮頸癌患者的5年生存率明顯降低。Castelli等[10]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，晚期直腸癌患者的HLA-E表達(dá)水平明顯高于早期患者。Gornalusse等[11]的研究顯示，HLA-G、HLA-E可對宮頸癌進(jìn)行診斷和預(yù)后評估。本研究中也得到相似的結(jié)果，HLA-G、HLA-E蛋白的陽性表達(dá)率隨宮頸病變嚴(yán)重程度增加而升高，且相關(guān)性分析顯示，二者呈正相關(guān)關(guān)系。

宮頸癌是一種由多基因誘導(dǎo)而發(fā)生的疾病，被人們廣泛認(rèn)知的是高危型HPV的持續(xù)感染，宮頸癌中E6和E7是HPV特異性癌蛋白，可通過干擾基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂、抑制凋亡，這種機(jī)制在原癌基因的激活中發(fā)揮了重要的作用，可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的失調(diào)[12]。多數(shù)女性在感染HPV后可誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，病毒被自然清除且病變消退，而少數(shù)感染不能及時清除的患者會導(dǎo)致疾病進(jìn)展，甚至發(fā)生癌變。研究顯示，不同病變程度，機(jī)體HPV的負(fù)荷量呈動態(tài)變化[13]。寧雪朋等[14]對140例宮頸病變的患者進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者的HPV陽性率明顯高于宮頸炎患者，且隨著癌變惡性程度的增加，HPV的陽性率也隨之增加。本研究中，宮頸癌組織中HPV陽性率為89.33%，高于慢性宮頸炎組織和CIN組織，且慢性宮頸炎組織中HPV陽性率低于CIN組組織，與既往研究結(jié)果相符。

在宮頸病變中，HLA-G、HLA-E和HPV均可導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)失調(diào)，相關(guān)性研究有利于理解宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。有研究指出，多種細(xì)胞因子在HLA-G、HLA-E表達(dá)通路和HPV致癌通路中同時發(fā)揮作用[15]。Swets等[16]研究表明，HPV E6蛋白與p53相互結(jié)合后可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，而p53可調(diào)節(jié)HLA-G的表達(dá)，參與腫瘤的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，HLA-E 可促進(jìn)核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）靶基因cIAP1、cIAP2的表達(dá)，而HPV18 E6蛋白是介導(dǎo)NF-κB磷酸化的重要因子，發(fā)揮NF-κB的抗凋亡作用[17]。本研究結(jié)果顯示，HLA-G、HLA-E的相對表達(dá)量與HPV陽性率均呈正相關(guān)。為進(jìn)一步研究HLA-G、HLA-E與HPV感染的相關(guān)性，本研究分析了不同HPV感染狀態(tài)的宮頸癌細(xì)胞中這兩種抗原的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，HLA-G、HLA-E在感染HPV的細(xì)胞中的相對表達(dá)量均明顯升高，且與病毒感染類型無關(guān)。在HeLa（HPV16+）細(xì)胞中，沉默E6基因表達(dá)后，HLA-E、HLA-G蛋白的相對表達(dá)量均明顯下降，再次證明HLA-G、HLA-E的表達(dá)與HPV感染的相關(guān)性，同時也說明HPV感染導(dǎo)致的HLA-G、HLA-E表達(dá)水平上升可能是腫瘤發(fā)生的重要途徑，且E6蛋白在此過程中起到重要的作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，HLA-G、HLA-E的表達(dá)水平與HPV感染均隨著宮頸病變程度的增加而升高，且相互之間存在正相關(guān)關(guān)系，這3種指標(biāo)有望作為宮頸癌早期篩查的重要標(biāo)志物，為疾病的預(yù)防和治療提供新的思路。