曾 林，向 婷，王天沛，胡 霞，唐宏圖，3△

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065； 2.解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院，湖北 武漢 430070；3.針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430061)

糖尿病(DM)是胰島素分泌的缺陷或(和)胰島素作用障礙所導(dǎo)致的一組以慢性高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病以高血糖為主要標志，誘發(fā)各種嚴重的并發(fā)癥，是糖尿病致死、致殘的主要原因[1]。長期以來，胰島素抵抗被認為是2型糖尿病發(fā)病的主要機制，而胰島素抵抗最主要的分子生物學(xué)原因是胰島素信號傳導(dǎo)減弱或受阻。胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑必須是胰島素首先與靶細胞膜上的受體結(jié)合才能發(fā)揮其生物效應(yīng)[2]，所以胰島素受體是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因而對胰島素受體的研究在科研和臨床上都有重要作用。本實驗通過對DM、糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)大鼠血脂、炎癥因子以及肝臟組織的胰島素受體(InsR)基因表達的觀察，擬探討中醫(yī)艾灸對防治糖尿病及糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用機理。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選擇SPF級雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量為(200±20)g(3月齡)，實驗動物由湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[實驗動物許可證號：syxk(鄂)2017-0067]提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實驗過程完全符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器

鏈尿佐菌素(Sigma)；InsR(PCR試劑盒，谷歌生物科技有限公司)；TNF-α(Elisa試劑盒，美國ADL生物科技公司)；IL-6 (Elisa試劑盒，美國ADL生物科技公司)；SLAN全自動熒光定量PCR儀(上海宏石醫(yī)療科技公司)；酶標儀(北京市格雷斯普科技開發(fā)公司)；DYY-Ш型電泳槽(北京市六一儀器廠)；HDJ-2核酸蛋白分析儀(江蘇興化分析儀器廠)；DKB-501A型恒溫水槽(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；XKA-2200離心機(湖南長沙市湘儀集團公司)；自動生化分析儀(上海維世康醫(yī)用電子有限公司)；動物實驗用艾條(河南南陽漢方艾葉有限公司)。

1.3 造模方法

隨機選取15只大鼠作為正常對照組(A組)，另60只大鼠禁食不禁水12 h后，左下腹腔注射鏈脲佐菌素(劑量為50 mg/kg)[3]。注射72 h后開始測血糖，凡血糖水平在16.7 mmol/L以上者列為糖尿病模型大鼠[4]。

1.4 實驗分組和干預(yù)方法

從造模成功的糖尿病模型大鼠中隨機抓取15只作為糖尿病模型組(B組)，再隨機抓取15只作為15 minDM艾灸治療組(C組)；剩余大鼠繼續(xù)正常喂養(yǎng)4周成糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠模型，再隨機分為DPN模型組(D組)15只、15 minDPN艾灸治療組(E組)15只。

1.4.1 A組 不造模，不治療。

1.4.2 B組 造模成功后不行艾灸治療，正常喂養(yǎng)。

1.4.3 C組 造模成功后，取大鼠關(guān)元、雙側(cè)足三里、胰俞穴[5]，用實驗動物用艾條(規(guī)格15.0 cm×0.5 cm)對各穴位先后進行懸灸，艾條距離穴位約5 cm，每穴15 min，每天1次，連續(xù)治療4周后取材檢測。

1.4.4 D組 不行艾灸治療，正常喂養(yǎng)。

1.4.5 E組 治療方法同C組。

1.5 指標檢測

1.5.1 血脂檢測 于4周治療結(jié)束后和8周治療結(jié)束后空腹眼底靜脈采血，取血2 mL于促凝管中，室溫靜置30 min，3 500 r/min離心15 min，取血清用自動生化分析儀檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C。

1.5.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6含量的Elisa檢測 第4周治療結(jié)束后和第8周治療結(jié)束后，用10%水合氯醛麻醉，麻醉狀態(tài)下摘眼球取血2 mL于干燥試管中，室溫放置約30 min，3 500 r/min離心15 min，取血清用Elisa方法檢測TNF-α、IL-6的含量。

1.5.3 肝臟胰島素受體InsR的PCR檢測 在第4周、8周治療結(jié)束后，用10%水合氯醛麻醉，后將大鼠斷頭處死，迅速取出肝臟，切成2 mm厚小條狀，然后放入液氮中，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

Trizol Rengent提取肝臟組織內(nèi)總RNA，測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，PCR反應(yīng)擴增目的基因，反應(yīng)條件為：50℃，2 min；95℃，2 min；95℃，15 s，退火15 s，72℃，45 s 3組一循環(huán)，共循環(huán)40次；72℃，10 min。引物序列見表1。采用Ct值比較法分析。

表1 引物序列表

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 “雙固一通”艾灸法對各組大鼠血脂的影響

C組與B組比較，TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)；E組與D組比較，TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)。詳見表2～3。

表2 各組大鼠4周后血脂的變化

表3 各組大鼠8周后血脂的變化

2.2 “雙固一通”艾灸法對各組大鼠TNF-α、IL-6的影響

B組和D組血清腫瘤壞死因子TNF-α、白介素IL-6的含量顯著高于A組(P<0.05)；與B組比較，C組大鼠TNF-α、IL-6的含量均降低(P<0.05)；與D組比較，E組大鼠TNF-α、IL-6的含量均降低(P<0.05)。詳見表4～5。

表4 各組大鼠4周后TNF-α、IL-6的檢測結(jié)果

表5 各組大鼠8周后TNF-α、IL-6的檢測結(jié)果

2.3 “雙固一通”艾灸法對各組大鼠肝臟胰島素抵抗 mRNA表達的影響

肝臟InsR mRNA擴增曲線見圖1。B組和D組肝臟胰島素受體InsR表達明顯低于A組(P<0.05)；C組與B組相比，InsR表達明顯增加(P<0.05)；E組與D組相比，InsR表達明顯增加(P<0.05)。詳見表6。

圖1 肝臟InsR mRNA擴增曲線

表6 各組大鼠InsR mRNA表達的影響

3 討論

中醫(yī)學(xué)將糖尿病稱之為“消渴”。糖尿病周圍神經(jīng)病變在古醫(yī)籍中無確切的病名，但長期以來糖尿病周圍神經(jīng)病變與“消渴”都是密切聯(lián)系在一起的?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》時期已較為詳細的記載了消渴的病因、病機、癥狀等相關(guān)內(nèi)容?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》云：“此肥美之所發(fā)也，引人必數(shù)食甘美多肥也。肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴?！泵鞔_指出消渴病的病因和病機，而這些傳統(tǒng)論述與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究所發(fā)現(xiàn)的飲食失控可誘發(fā)糖尿病的理論完全吻合。唐代初期著名醫(yī)家甄立言《古今錄驗方》記載消渴臨床癥狀為“渴而飲水多，小便數(shù)，無脂似麩片甜?！蓖鯛c《外臺秘要》指出:“消渴者，每發(fā)小便至甜。”《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》所云：“脾病不能為胃行其津液，四肢不得稟水谷之氣，氣日以衰，脈道不利，筋骨肌肉皆元氣以生。”說明糖尿病周圍神經(jīng)病變的臨床表現(xiàn)是以四肢麻木不仁為主；而脾虛，化生津液不足，營陰虧耗，從而引起氣血虧虛，不能濡養(yǎng)筋脈而導(dǎo)致四肢不溫而痛；氣虛血行不暢，久而成瘀。

中醫(yī)針灸“治未病”理論強調(diào)以正氣為本，固護先天與后天是其基礎(chǔ)和關(guān)鍵，并且通過“治”達到“防”的目的，換句話說，“治”是積極的、主動的“防”。對于“防”，其意義有三，一是預(yù)防疾病，二是療疾防變，三是調(diào)節(jié)機能?？偠灾樉摹爸挝床　钡谋举|(zhì)特征是“固護正氣、以治為防”[6]?！半p固”即固護人體先天之本和后天之本，“一通”即通瀉病邪。足三里為胃經(jīng)合穴，胃腑之下合穴，針之可調(diào)理脾胃補益氣血生化之源，固護后天之本；關(guān)元為任脈腧穴，也是三陰經(jīng)與任脈交會穴，為元陰、元陽關(guān)藏出入之所，針之可益精補氣、扶助人體先天之本。足三里、關(guān)元配合，兼顧先天和后天，補益正氣，再與治療消渴的效穴胰俞相配伍，則可達到以治為防、防微杜漸的目的[7]?！半p固一通”針灸法以中醫(yī)發(fā)病學(xué)和防治學(xué)理論為基礎(chǔ)，堅持“未病先防，既病防變”的中醫(yī)“治未病”治療原則，注重調(diào)動機體整體的潛在能力，以治為防，防治結(jié)合[8]。

灸法在對糖尿病及其并發(fā)癥的防治方面也有極為豐富的記載?！肚Ы鹨矸健份d：“消渴咽喉干，灸胃管下俞三穴各百壯，穴在背第八椎下橫三寸，間寸灸之”。又有“食不充饑灸三里”之說。在現(xiàn)代臨床研究方面，對糖尿病患者采用逢時灸法[9-10]、溫針隔橘皮灸[11]可明顯降低患者血糖。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在治療糖尿病周圍神經(jīng)病變上，運用溫和灸治療后患者空腹血糖、糖化血紅蛋白、NO、丙二醛與血漿內(nèi)皮素均有明顯改善，且與西藥組有明顯差異[12]。亦有報道稱通過溫針灸法可以顯著改善DPN患者的麻木、疼痛等癥狀，改善MNSI量表評分，提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度[13]。在現(xiàn)代動物實驗方面，李石良等[14]觀察到艾灸可良性調(diào)節(jié)NIDDM大鼠脂代謝紊亂。另有學(xué)者曹某[15]表明艾灸可更有效的清除自由基，發(fā)揮胰島素(INS)的作用，改善患者的代謝狀態(tài)。

2型糖尿病及周圍神經(jīng)病變都存在著一定程度的脂代謝紊亂[16]，本實驗也證實了這一觀點。這是由于胰島素分泌和作用的缺陷，導(dǎo)致脂代謝異常，出現(xiàn)高血糖、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥等，引發(fā)出多種并發(fā)癥[17]。有研究表明，胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)生的始動環(huán)節(jié)[18-19]。胰島素抵抗是指胰島素分泌量在正常水平時，刺激靶細胞攝取和利用葡萄糖的生理效應(yīng)顯著減弱，或者是靶細胞攝取和利用葡萄糖的生理效應(yīng)正常進行，但需要超常量的胰島素，從而產(chǎn)生的一系列病理和臨床表現(xiàn)[20]。脂肪分解代謝過程受到激素敏感性脂肪酶(HSL)與脂肪組織甘油三酯脂酶調(diào)控[21]，而胰島素抵抗使脂肪組織的激素敏感脂酶活性增強，使脂肪組織釋放大量游離脂肪酸，后者進入肝臟成為合成TG、TC及極低密度脂蛋白(VLDL)的原料；胰島素抵抗還使脂蛋白酯酶活性減低，LDL受體功能減退或負荷加重，使富含TG的脂蛋白清除減慢，滯留于血循環(huán)，在膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白的作用下，HDL、LDL中的膽固醇與VLDL和乳糜微粒間的TG交換加速，使HDL-TG增加，在活性增高的肝臟甘油三酯酶作用下，HDL中的膽固醇成分減少，造成TG升高、HDL膽固醇降低[22]。LDL與VLDL間的TG與膽固醇酯的轉(zhuǎn)運形成了富含TG的LDL顆粒，后者易于被肝脂酶水解，形成小而密的脂蛋白，易被氧化[23]，更易導(dǎo)致多種并發(fā)癥的產(chǎn)生。綜上所述，改善胰島素抵抗，可以在一定程度上控制血脂紊亂，對治療糖尿病及并發(fā)癥有重要意義。

TNF-α、IL-6為調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫功能和代謝過程的細胞因子，主要由活躍的單核巨噬細胞受脂多糖的刺激而產(chǎn)生。近期的研究顯示，2型糖尿病患者均存在高胰島素血癥及免疫反應(yīng)。長期的不良刺激導(dǎo)致機體固有免疫系統(tǒng)適應(yīng)不良，非特異性免疫系統(tǒng)被激活，單核細胞、巨噬細胞、T細胞、脂肪細胞和內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生大量細胞因子(主要是TNF-α、IL-6)，導(dǎo)致胰島β細胞分泌功能受損及產(chǎn)生胰島素抵抗[24-26]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病的主要病理特征是胰島細胞的胰島素分泌功能缺陷和胰島素抵抗[27]。大多數(shù)糖尿病患者發(fā)生胰島素抵抗的分子機制是靶細胞胰島素受體后信號傳導(dǎo)通路的缺陷所導(dǎo)致[28]。胰島素與受體的α亞基結(jié)合后，在使β亞基的酪氨酸殘基自身磷酸化的同時使胰島素受體底物的多個酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，將信號下傳。β亞基具有特異的酪氨酸激酶(Tyrosine kinase，TK)活性的區(qū)域，TK能催化ATP的γ-磷酸基轉(zhuǎn)移到受體蛋白酪氨酸殘基上，引發(fā)細胞內(nèi)一系列蛋白底物磷酸化或去磷酸化的級聯(lián)反應(yīng)，介導(dǎo)胰島素的生物學(xué)效應(yīng)。因此，InsR中TK異常是產(chǎn)生胰島素抵抗的重要原因[29]。近年有研究發(fā)現(xiàn)，胰島β細胞也同樣存在胰島素信號通路，這也越發(fā)促進了人們對β細胞胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的重視[30]。現(xiàn)代研究表明，模型組大鼠肝臟胰島素受體mRNA表達明顯低于正常水平[31]。

本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“雙固一通”艾灸法治療后，改善了糖尿病及周圍神經(jīng)病變大鼠血脂紊亂的情況，使得模型大鼠血清內(nèi)TNF-α、IL-6含量下降，也使得糖尿病和周圍神經(jīng)病變大鼠的胰島素受體數(shù)量增加、功能增強，改變了胰島素受體數(shù)量與功能缺陷所導(dǎo)致的胰島素作用減弱的狀態(tài)，進而改善胰島素抵抗情況，這可能也是“雙固一通”艾灸法防治糖尿病及糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用機制之一。