張立攀, 朱云亮

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 山東 濟(jì)寧 272029)

急性腦梗死(Acute cerebral infarction，ACI)為臨床常見卒中類型，約占全部腦卒中60%～80%，且近年來，隨著我國人口結(jié)構(gòu)改變，該病發(fā)病率逐年增長，受到臨床高度關(guān)注[1,2]。ACI后極易出現(xiàn)缺血性腦組織損傷，研究認(rèn)為以核因子-E2相關(guān)因子2(Nrf2)為核心的Keap1-Nrf2/ARE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有抗氧化應(yīng)激、抗炎癥損傷、減輕鈣離子超載、抗細(xì)胞凋亡等多重作用，在維持腦組織細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)方面具有重要意義[3]。腦蛋白水解物作為腦血管輔助藥物，對ACI血小板活化抑制作用顯著，可緩解炎癥反應(yīng)，減輕腦損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)[4]。丁苯酞軟膠囊可阻斷ACI所致多個(gè)病理環(huán)節(jié)，維持腦缺血狀態(tài)下腦能量代謝、促進(jìn)缺血區(qū)域腦血流量恢復(fù)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能缺損癥狀[5]。本研究首次聯(lián)合采用丁苯酞軟膠囊、腦蛋白水解物治療ACI，分析其對患者神經(jīng)功能(NIHSS)評分及Keap1-Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料:選取2016年8月至2019年7月我院93例ACI患者作為研究對象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合依據(jù)《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》中ACI相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，并經(jīng)頭顱CT或MRI證實(shí)；②發(fā)病至入院時(shí)間<72h；③患者或其家屬自愿簽署本研究知情同意書；④本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)；排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有出血性傾向疾病者；②合并心、肝、腎等重要臟器功能障礙；③伴有免疫系統(tǒng)或血液系統(tǒng)疾病者；④發(fā)病前兩周內(nèi)行重大手術(shù)者；⑤合并惡性腫瘤者；⑥過敏體質(zhì)或?qū)Ρ狙芯克盟幬锞哂惺褂媒砂Y者。簡單隨機(jī)化分組，各31例。三組年齡、性別、發(fā)病時(shí)間、梗死部位、病情程度、合并癥等基線資料無明顯差異(P>0.05),見表1。

表1 三組臨床資料對比

1.2方 法

1.2.1治療方法:三組均根據(jù)《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》制定常規(guī)治療方案，包括穩(wěn)定生命體征、控制血壓血糖、吸氧、糾正水電解質(zhì)平衡等基礎(chǔ)治療，同時(shí)根據(jù)患者病情程度予以抗血小板聚集、改善腦功能、改善腦循環(huán)等藥物治療；于此基礎(chǔ)上，對照A組予以腦蛋白水解物(北京賽生藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H11022185)治療，20mL腦蛋白水解物+250mL生理鹽水，靜脈滴注，60～120min滴完，1次/d；對照B組予以丁苯酞軟膠囊(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20050299)治療，200mg/次，3次/d；觀察組予以蛋白質(zhì)水解物聯(lián)合丁苯酞軟膠囊治療，腦蛋白水解物、丁苯酞軟膠囊用法用量同對照A、B組。三組均連續(xù)治療14d。

1.2.2檢測方法:空腹?fàn)顟B(tài)下抽取5mL肘靜脈血，高速離心處理(3000r/min，10min)，留取血清待檢，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定脂聯(lián)素(APN)、血管性假血友病因子(vWF)、白介素(IL)-8、IL-19、腫瘤壞死因子(TNF)-α，比色法測定血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，試劑盒購自南京建成生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行；同時(shí)抽取外周血5mL采用免疫印跡法測定Keap1-Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，肝素抗凝后，分離出外周血淋巴細(xì)胞，提取PBMC，采用1640培養(yǎng)液洗滌2次，經(jīng)重懸后收集至PBMC，加入細(xì)胞裂解液裂解，離心收集上層清夜取得總蛋白，BCA法測定并配平蛋白濃度，電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移相應(yīng)蛋白至PVDF膜上，以5%脫脂牛奶封閉液室溫下封閉2h，加入一抗4℃孵育過夜，次日TBST洗滌10min，共3次，加入經(jīng)熒光標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育1h后洗膜，TBST洗滌10min，共3次，ECL發(fā)光顯影，采用QuantityOne軟件測定灰度值，計(jì)算蛋白條帶灰度值與內(nèi)條帶灰度值比值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.3觀察指標(biāo):①臨床療效，參考《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》判斷患者治療后療效，基本控制：NIHSS評分下降>90%，病殘程度為0級；顯效：NIHSS評分下降46%～90%，病殘程度為1～3級；有效：NIHSS評分下降18%～45%；無效：NIHSS評分降低≤17或增加。總有效率=(基本控制+顯效+有效)/31×100%。②治療前、療程結(jié)束后神經(jīng)功能及日常生活活動(dòng)能力，以美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評分評估神經(jīng)功能，分值越低，神經(jīng)功能恢復(fù)越良好[7]；Barthel指數(shù)評估日常生活活動(dòng)能力，分值越高，日常生活活動(dòng)能力越強(qiáng)。③治療前、療程結(jié)束后內(nèi)皮功能指標(biāo)APN、vWF水平。④治療前、療程結(jié)束后氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA水平。⑤治療前、療程結(jié)束后血清炎性因子IL-19、IL-8、TNF-α水平。⑥治療前、療程結(jié)束后Keap1-Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1臨床療效:觀察組臨床總有效率高于對照A、B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對照A、B組臨床總有效率相比，無明顯差異(P>0.0167),見表2。

表2 三組臨床療效對比n(%)

2.2NIHSS評分、Barthel指數(shù):三組NIHSS評分、Barthel指數(shù)組間、不同時(shí)間點(diǎn)的差異及組間·不同時(shí)間點(diǎn)交互作用均數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F1=12.314，F(xiàn)2=26.124，F(xiàn)3=19.052，F(xiàn)4=9.126，F(xiàn)5=25.134，F(xiàn)6=16.247，P<0.05)，三組治療前NIHSS評分、Barthel指數(shù)相比，無明顯差異(P>0.05)；療程結(jié)束后，觀察組NIHSS評分低于對照A、B組，Barthel指數(shù)高于對照A、B組(P<0.05),見表3。

表3 三組NIHSS評分 Barthel指數(shù)對比分)

2.3內(nèi)皮功能指標(biāo):三組APN、vWF水平組間、不同時(shí)間點(diǎn)差異及組間·不同時(shí)間點(diǎn)交互作用均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F1=10.125，F(xiàn)2=24.129，F(xiàn)3=19.742，F(xiàn)4=9.256，F(xiàn)5=25.175，F(xiàn)6=16.167，P<0.05)，三組治療前血清APN、vWF水平相比，無明顯差異(P>0.05)；療程結(jié)束后，觀察組血清vWF水平低于對照A、B組，APN水平高于對照A、B組(P<0.05)(P<0.05),見表4。

表4 三組內(nèi)皮功能指標(biāo)水平對比

2.4血清SOD、MDA水平:三組SOD、MDA水平組間、不同時(shí)間點(diǎn)差異及組間·不同時(shí)間點(diǎn)交互均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F1=9.745，F(xiàn)2=15.169，F(xiàn)3=13.256，F(xiàn)4=10.129，F(xiàn)5=27.141，F(xiàn)6=13.196，P<0.05)，三組治療前血清MDA、SOD水平相比，無明顯差異(P>0.05)；療程結(jié)束后，觀察組血清MDA水平低于對照A、B組，SOD水平高于對照A、B組(P<0.05),見表5。

表5 三組血清SOD MDA水平對比

2.5血清炎性因子:三組IL-19、IL-8、TNF-α水平組間、不同時(shí)間點(diǎn)差異及組間·不同時(shí)間點(diǎn)交互均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F1=8.941，F(xiàn)2=16.174，F(xiàn)3=12.185，F(xiàn)4=11.254，F(xiàn)5=27.276，F(xiàn)6=14.251，F(xiàn)7=9.845，F(xiàn)8=24.312，F(xiàn)9=12.141，P<0.05)，三組治療前血清IL-19、IL-8、TNF-α水平相比，無明顯差異(P>0.05)；療程結(jié)束后，觀察組血清IL-19、IL-8、TNF-α水平低于對照A、B組(P<0.05)(P<0.05),見表6。

表6 三組血清炎性因子對比

2.6Keap1-Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白:三組Keap1、NQO1、ARE、Nrf2表達(dá)水平組間、不同時(shí)間點(diǎn)差異及組間·不同時(shí)間點(diǎn)交互均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F1=8.172，F(xiàn)2=17.254，F(xiàn)3=14.135，F(xiàn)4=10.944，F(xiàn)5=25.126，F(xiàn)6=12.361，F(xiàn)7=8.125，F(xiàn)8=25.612，F(xiàn)9=15.141，F(xiàn)10=9.265，F(xiàn)11=24.756，F(xiàn)12=10.695，P<0.05)，三組治療前Keap1、NQO1、ARE、Nrf2表達(dá)水平相比，無明顯差異(P>0.05)；療程結(jié)束后，觀察組Keap1表達(dá)水平低于對照A、B組，NQO1、ARE、Nrf2表達(dá)水平高于對照A、B組(P<0.05),見表7。

表7 三組Keap1-Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白對比

3 討 論

ACI治療原則為抑制血栓擴(kuò)展，縮小梗死范圍，盡快恢復(fù)缺血區(qū)域腦灌注，同時(shí)改善腦微循環(huán)，保護(hù)腦細(xì)胞，減輕缺血后再灌注損傷，防治腦細(xì)胞凋亡[8]。丁苯酞軟膠囊、腦蛋白水解物為腦血管疾病治療常用藥物，目前臨床多單一采用二者治療ACI，關(guān)于其聯(lián)合應(yīng)用較為鮮見。本研究為進(jìn)一步提高治療效果，聯(lián)合采用丁苯酞軟膠囊、腦蛋白水解物治療ACI，結(jié)果顯示療程結(jié)束后，觀察組NIHSS評分低于對照A、B組，Barthel指數(shù)高于對照A、B組，臨床療效優(yōu)于對照A、B組，充分說明丁苯酞軟膠囊聯(lián)合腦蛋白水解物治療ACI，可顯著改善患者神經(jīng)功能及日常生活活動(dòng)能力，提高治療效果。此外，動(dòng)脈硬化及血管內(nèi)皮損傷的病理過程影響患者血清APN、vWF水平，血清APN、vWF水平可作為反映ACI患者腦血管受損程度及內(nèi)皮功能[9]。本研究中，療程結(jié)束后，觀察組血清vWF水平低于對照A、B組，APN水平高于對照A、B組，提示丁苯酞軟膠囊聯(lián)合腦蛋白水解物可顯著改善患者血清APN、vWF水平，亦從血清層面進(jìn)一步證實(shí)丁苯酞軟膠囊聯(lián)合腦蛋白水解物治療效果。原因在于①丁苯酞軟膠囊通過抑制谷氨酸釋放，解除微血管痙攣，抑制血小板聚集；保護(hù)血管內(nèi)皮、加速血管生成，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立；減少線粒體電子傳遞鏈細(xì)胞色素C釋放，抑制神經(jīng)元凋亡；保護(hù)線粒體功能，避免線粒體酶自我損傷，改善腦缺血再灌注引起的線粒體腫脹與功能異常；抑制氧化酶激活，防止脂質(zhì)過氧化，發(fā)揮對缺血性神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用；②腦蛋白水解物可增加腦組織對氧利用率；增加腦組織無氧代謝時(shí)三磷酸腺苷生成；鈉離子拮抗，抑制鈣離子內(nèi)流，降低氧自由基生成；調(diào)節(jié)腦內(nèi)抑制性、興奮性物質(zhì)平衡及有關(guān)激素生成，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)；③丁苯酞軟膠囊、腦蛋白水解物作用機(jī)制不同，聯(lián)合應(yīng)用，作用協(xié)同補(bǔ)充，進(jìn)一步提高治療效果。

ACI后隨局部側(cè)支循環(huán)開放，受損腦組織缺血再灌注，致使大量自由基釋放，導(dǎo)致腦細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生微循環(huán)障礙及破壞腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)，為造成腦功能障礙的主要因素之一[10]。MDA為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中的代謝產(chǎn)物，可間接反應(yīng)體內(nèi)自由基水平，代表細(xì)胞受自由基損傷涉及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度；SOD作為體內(nèi)自由基清除劑，可抑制氧自由基損傷腦細(xì)胞，減少缺血再灌注時(shí)腦組織過氧化產(chǎn)物生成，增加大腦皮層耐缺氧能力。此外，Keap1-Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路作為一種氧化應(yīng)激信號通路，在急性腦缺血后再灌注損傷中的作用可能是通過激活下游因子表達(dá)而發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等作用。本研究中，療程結(jié)束后，觀察組血清MDA、IL-19、IL-8、TNF-α、Keap1水平低于對照A、B組，SOD、NQO1、ARE、Nrf2水平高于對照A、B組，提示丁苯酞軟膠囊聯(lián)合腦蛋白水解物ACI，可降低患者血清MDA、IL-19、IL-8、TNF-α水平，提高SOD水平，調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路，從而達(dá)到抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)目的。原因在于丁苯酞軟膠囊可加強(qiáng)自由基清除，抑制自由基產(chǎn)生，減少腦組織損傷后組織內(nèi)有害物質(zhì)增加，降低炎性反應(yīng)，維護(hù)腦組織營養(yǎng)代謝；腦蛋白水解物具有鈣離子拮抗作用，可有效抑制鈣離子內(nèi)流，減少氧自由基生成，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕ACI繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，二者聯(lián)合應(yīng)用，可增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激能力，抑制炎性反應(yīng)。

綜上所述，丁苯酞軟膠囊聯(lián)合腦蛋白水解物治療ACI，可明顯改善患者血管內(nèi)皮功能，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白，改善神經(jīng)功能及日常生活活動(dòng)能力，效果較為顯著。但本研究樣本量較小，還需臨床多中心、多渠道取樣，作進(jìn)一步證實(shí)。