伍艷君 ，鄔開會，劉茜，王依瀅，邱國平，徐進，盛華均，朱淑娟

1.重慶醫(yī)科大學神經科學研究中心，重慶醫(yī)科大學人體解剖學教研室，重慶市 400016；2.重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院，重慶市408400

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是最常見的與年齡相關的神經退行性疾病，慢性進行性加重，主要病理特點包括由β 淀粉樣蛋白肽(Amyloid beta peptide,Aβ)沉積形成的細胞外老年斑、過度磷酸化的Tau 蛋白形成的神經原纖維纏結，以及大量神經元丟失[1]。淀粉樣蛋白級聯(lián)假說認為，Aβ 沉積是多因素發(fā)病機制中的初始事件，可引發(fā)一系列導致癡呆的事件[2?3]。AD 的發(fā)生發(fā)展也與大腦葡萄糖利用和能量代謝損傷有關[4?6]。因AD 有胰島素生成減少和胰島素受體抵抗現(xiàn)象，也被稱為“3 型糖尿病”[7?9]。在胰島素抵抗機制中，磷脂酰肌醇?3 激酶(phosphatidylinositol?3 kinase,PI3K)、糖原合成酶激酶?3α(glycogen synthe?sis kinase?3α,GSK3α)作為PI3K/GSK3α 信號轉導途徑中的重要蛋白，與Aβ的代謝關系密切[10?11]。

本研究以AD 模型APP/PS1雙轉基因小鼠為對象，觀察電針對APP/PS1 小鼠皮質內老年斑和PI3K/GSK3α相關蛋白表達的影響，探討電針對小鼠皮質內胰島素信號通路的調節(jié)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康同窩3 月齡等體質量雄性野生型C57 小鼠6只為對照組；同月齡等體質量健康雄性APP/PS1 雙轉基因小鼠隨機數(shù)字表法分為模型組和電針組，每組各6 只，體質量24～28 g。小鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證號SCXK(京)2014?004。

小鼠飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學動物實驗中心SPF 級動物房，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，相對濕度40%～60%，光照和黑暗周期各12 h，自由飲食。適應性喂養(yǎng)2周左右，剪取鼠尾3～5 mm，堿裂解法提取小鼠DNA，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增，檢測APPswe和PSΔE9基因表達。瓊脂糖凝膠電泳，拍照并分析結果，具有APP、PS1 雙陽性條帶的樣本來源于APP/PS1 雙轉基因小鼠，兩條帶均為陰性的樣本來自野生型C57小鼠。

本實驗所有操作均符合重慶醫(yī)科大學動物實驗倫理標準。

1.2 主要試劑

4G8一抗(SIG?39220?200)：美國COVANCE公司。GSK3α 一 抗(ab131344)：美國ABCAM公司。pS21?GSK3α 一 抗(9316S)：美國CELL SIGNALING 公司。P85α 一抗(AF5112)、P110α 一抗(AF5112)：美國AFFINITY 公司。GAPDH 一抗(10494?1?AP)：重慶鼎國生物科技有限責任公司。HRP 標記羊抗兔IgG 抗體(L153A)：重慶萊博斯生物科技有限公司。電針儀：汕頭市醫(yī)用設備有限公司。電泳儀、電轉儀和凝膠成像儀：美國伯樂公司。石蠟切片機：德國萊卡公司。PCR 儀：美國賽默飛公司。無菌針灸針：北京中研太和醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

鑒定后，電針組0.3%戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔注射麻醉，一次性針灸針(直徑0.18 mm、長25 mm)針刺小鼠百會(向前斜刺2 mm)和兩側腎俞(向內斜刺4 mm)，穴位定位參照《實驗針灸學》動物穴位圖譜。電針儀一對正負極分別接百會和一側腎俞，另一對正負極接另一側腎俞和同側用紗布浸濕的皮膚，電針頻率2 Hz，電流2 mA,每次15 min，每天1 次，7 d 為1個療程，共計2個療程，療程期間休息1 d。電針時間和操作人員固定。

對照組和模型組在相同的時間抓取和麻醉，不針刺。

1.4 標本采集

干預結束后，小鼠0.3%戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔注射麻醉，0.9%氯化鈉溶液心尖快速灌注約40 ml。斷頭，完整取出鼠腦，剝離腦組織。一側皮質-80 ℃冰箱凍存，用于Western blotting 檢測；另一側4%多聚甲醛固定，石蠟切片，用于免疫組化染色。

1.5 免疫組化染色

鏡下選取組織切片，二甲苯Ⅰ中65 ℃烤箱內脫蠟1 h，二甲苯Ⅱ中常溫脫蠟3 min。100%、95%、80%和75%梯度酒精水化各5 min；0.01 mol/L PBS 水洗3次，每次5 min。滴加3%過氧化物酶，37 ℃水浴孵育15 min。0.01 mol/L PBS 水洗3 次，每次5 min；95 ℃水浴修復，自然冷卻到室溫。0.01 mol/L PBS 水洗3次，每次5 min，滴加88%甲酸常溫孵育10 min(僅染老年斑需要)。0.01 mol/L PBS 水洗3 次，每次5 min，滴加5% BSA，37 ℃水浴封閉。滴加老年斑(4G8,1∶250)、P85α(1∶200)、P110α(1∶50)、GSK3α(1∶50)和pS21?GSK3α (1∶100)一抗，4 ℃冰箱中過夜。37 ℃水浴復溫40 min。0.01 mol/L PBS 水洗4 次，每次5 min；滴加二抗，37 ℃水浴孵育30 min。0.01 mol/L PBS 水洗4 次，每次5 min；滴加SABC 信號放大劑，37 ℃水浴孵育。0.01 mol/L PBS 水洗4 次，每次5 min。DAB 染色，蘇木素染核(僅染老年斑需要)，鏡下觀察結果。70%～100%梯度酒精脫水，二甲苯I、Ⅱ透明，各5 min。中性樹脂封片，常溫晾干，光學顯微鏡下觀察皮質內老年斑、P85α、P110α、GSK3α 和pS21?GSK3α 的分布，并拍照，保持光照強度及放大倍數(shù)一致。隨機取6 個區(qū)域，Image J 8.0 圖像分析系統(tǒng)測量平均積分光密度。

1.6 Western blotting

提取蛋白，加入蛋白裂解液研磨，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，共2次，吸取上清，BCA 法測蛋白濃度。取總蛋白50 μg 上樣，8% SDS?聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，250 mA 恒流電轉至PVDF 膜；5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，加入P85α (1∶1000)、P110α (1∶1000)、GSK3α (1∶1000)和pS21?GSK3α (1∶1000)一抗，4 ℃冰箱敷育過夜。PBST 洗膜3 次，每次10 min；滴加相應二抗(1∶10000)，37 ℃恒溫搖床孵育1 h，PBST 洗膜4 次，每次15 min；ECL 顯色，凝膠成像系統(tǒng)觀察。以GAPDH 為內參，計算分析蛋白條帶相對光密度值。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用Image J 8.0、Graphpad Prism 5軟件對數(shù)據進行分析，各實驗獨立重復6 次。計量資料以()表示，多組間比較采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 免疫組化染色

對照組皮質區(qū)無4G8 陽性斑塊，模型組和電針組小鼠皮質區(qū)均可見4G8 陽性斑塊。與模型組相比，電針組4G8 陽性斑塊顯著減少(P＜0.001)。見圖1、表1。

圖1 各組皮質區(qū)老年斑(免疫組化染色，×200)

GSK3α和pS21?GSK3α主要在神經元胞質表達。模型組GSK3α 蛋白水平較對照組和電針組均顯著升高(P＜0.001)；pS21?GSK3α 蛋白水平較對照組和電針組降低(P＜0.001)。見圖2、圖3、表1。

P85α 和P110α 均存在于神經元胞質內。模型組P85α 和P110α較對照組和電針組均明顯降低(P＜0.01)。見圖4、圖5、表1。

2.2 Western blotting

模型組pS21?GSK3α 蛋白表達明顯低于對照組和電針組(P＜0.01)，GSK3α蛋白表達高于對照組和電針組(P＜0.05)；P85α 和P110α 蛋白表達明顯低于對照組和電針組(P＜0.01)。見圖6、表2。

圖2 各組皮質區(qū)GSK3α表達(免疫組化染色，×200)

圖3 各組皮質區(qū)pS21-GSK3α表達(免疫組化染色，×200)

圖4 各組皮質區(qū)P85α表達(免疫組化染色，×200)

圖5 各組皮質區(qū)P110α表達(免疫組化染色，×200)

表1 免疫組化染色各組皮質區(qū)老年斑、GSK3α、pS21-GSK3α、P110α和P85α蛋白水平(IOD/AREA)

表2 Western blotting檢測各組GSK3α、pS21-GSK3α、P110α、P85α蛋白表達水平(/GAPDH)

3 討論

腦內胰島素既可由外周胰島β 細胞、胃抑制多肽細胞等分泌，穿過血腦屏障進入中樞神經系統(tǒng)，也可由腦內膠質細胞和神經元合成。胰島素與胰島素受體結合后，激活胰島素信號轉導通路，在神經調節(jié)、神經內分泌和代謝，以及學習記憶等方面發(fā)揮重要調節(jié)作用。胰島素受體在大腦皮層、海馬、嗅球、下丘腦等部位廣泛分布，特別是在神經元和突觸后[12]。胰島素信號通路破壞會使神經元出現(xiàn)代謝損傷，與認知功能下降關聯(lián)，逐漸發(fā)展為AD[13]。胰島素信號通路對胰島素不敏感時，出現(xiàn)代償性的高胰島素血癥，即胰島素抵抗。胰島素缺乏或胰島素抵抗與異常的能量代謝密切相關[4,14?15]。研究表明[16]，腦內出現(xiàn)胰島素抵抗是AD 發(fā)生的前兆，胰島素信號通路紊亂可能參與其發(fā)生機制，并最終與Aβ 相互影響，形成惡性循環(huán)。APP/PS1 雙轉基因小鼠在2 月齡時即可表現(xiàn)出葡萄糖耐量降低，早于AD病理學和認知下降[17?18]。推測胰島素信號通路受損可能加速AD病理進程[19?20]。

圖6 各組pS21-GSK3α、GSK3α、P110α和P85α蛋白表達(Western blotting)

PI3K?Akt 信號通路是胰島素信號的經典通路。PI3K 有4 種亞型，即1A、1B、2 和3。對胰島素跨膜轉導起作用的是1A，它由P85(調節(jié)亞基)和P110 (催化亞基)兩個亞基組成。P85 主要與胰島素受體底物結合，P110通過磷酸化細胞膜上的磷脂酰肌醇(phospha?tidylinositol,PI)，使胞內合成PIP、PIP2或PIP3，扮演胰島素跨膜信號傳導第二信使的角色，募集絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine?threonine kinase,Akt，又稱PKB)到細胞膜并磷酸化，激活并調節(jié)下游分子。P85 對P110 的穩(wěn)定、聚集以及對1A 型PI3K 的激活尤為必需。P85α 作為1A 型PI3K 表達最多的亞基，是PI3K?Akt 通路激活的始動環(huán)節(jié)。AD 患者尸檢發(fā)現(xiàn)，腦內P85α 和P110α 水平降低，阻斷胰島素信號通路，與胰島素抵抗一致[21]。

受損的PI3K?Akt信號通路失去正常調節(jié)能力，導致下游激酶分子GSK3 活性失調。GSK3 有GSK3α 和GSK3β 兩個亞型，其中GSK3α 與Aβ 的關系更為密切[22]。在Tg2576 小鼠中，GSK3α 活性增強，上調γ 分泌酶活性，促進Aβ生成，加速老年斑沉積[23]。

針灸是中醫(yī)治療“癡呆”的重要手段，能有效改善AD 發(fā)生發(fā)展過程中的一些病理生理機制，如抑制氧化應激、調節(jié)神經遞質和興奮性氨基酸的釋放、提高神經營養(yǎng)因子含量等[24?26]。

研究發(fā)現(xiàn)[27]，針刺治療可有效改善胰島素抵抗，但作用機制未明。本研究顯示，電針可升高APP/PS1雙轉基因小鼠皮質內P85α、P110α 和pS21?GSK3α 等蛋白的表達水平，降低過度增加的GSK3α蛋白表達，并減少皮質內老年斑。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)[28]，相同的電針刺激能夠提高APP/PS1 雙轉基因小鼠的學習、記憶和空間探索能力，并調節(jié)皮質區(qū)β?分泌酶1 (β?se?creting enzyme,BACE1)、胰島素降解酶(insulin?de?grading enzyme,IDE)等的表達。綜合分析認為，電針可通過調節(jié)P85α、P110α及下游pS21?GSK3α、GSK3α、BACE1 和IDE 等蛋白的表達水平，影響Aβ形成，從而改善腦內胰島素抵抗、老年斑沉積和認知減退。

另外，本研究顯示，GSK3α和pS21?GSK3α蛋白主要表達于神經元胞質內，模型組GSK3α 表達增多而pS21?GSK3α 表達減少。有研究顯示[29]，激活GSK3 能增強Tau 蛋白磷酸化，而胰島素能通過PI3K?Akt 信號通路抑制GSK3，降低Tau 蛋白磷酸化。本研究未涉及電針對Tau 蛋白磷酸化水平的影響，有待進一步研究。

綜上所述，電針能針對AD 病理生理機制，發(fā)揮多方位調節(jié)作用。研究電針多方位調節(jié)作用的扳機點，將是以后的重要研究方向之一。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。