高彥萍 呂和平 張 武 王國(guó)祥 吳雁斌 梁宏杰

(1甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅 蘭州 730070；2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，甘肅 蘭州 730070；3甘肅省馬鈴薯脫毒種薯(種苗)病毒檢測(cè)及安全評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070)

中國(guó)是全世界馬鈴薯(Solanum tuberosum)種植面積最大的國(guó)家，占全球種植面積的20%以上，但平均單產(chǎn)只有13.99 t·hm-2，比世界平均水平(16.07 t·hm-2) 低12.94%，病毒病是引起我國(guó)馬鈴薯低產(chǎn)的主要原因。馬鈴薯卷葉病毒(potato leafroll virus，PLRV)是目前嚴(yán)重影響馬鈴薯產(chǎn)量與品質(zhì)的主要病毒之一[1-4]。病毒檢測(cè)是馬鈴薯病毒病害診斷、測(cè)報(bào)、防治和脫毒種薯(苗)培育等過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。目前，PLRV 檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)[5-6]、普通反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)[7-8]、多重 RTPCR[9-10]、實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR(real-time RT-PCR)[11-12]以及基因芯片的DNA 微點(diǎn)陣等。ELISA 法雖然高通量，但程序不簡(jiǎn)便、靈敏度較低，存在假陽(yáng)性；而RTPCR、多重RT-PCR 和real-time RT-PCR 核酸檢測(cè)技術(shù)雖然具有靈敏度和特異性高以及多同步性等優(yōu)點(diǎn)，但儀器昂貴、成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，且存在技術(shù)難度問(wèn)題，僅局限于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，難于在生產(chǎn)實(shí)際中推廣應(yīng)用。Notomi 等[13]建立的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(loopmediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)，是一種針對(duì)靶基因的6 個(gè)特定區(qū)域設(shè)計(jì)4 對(duì)特異性引物，利用DNA 鏈置換聚合酶，在恒溫(60～65℃左右)條件下快速對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增的新型分子檢測(cè)技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、快速且適合于多種檢測(cè)環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域的基因檢測(cè)[14-17]。RT-LAMP 技術(shù)在植物病毒檢測(cè)方面的應(yīng)用亦有報(bào)道，表現(xiàn)出簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確的特點(diǎn)[18-19]。關(guān)于PLRV 的RT-LAMP 檢測(cè)方法已有研究報(bào)道，如采用濁度測(cè)定方法判讀擴(kuò)增結(jié)果[20]，但未進(jìn)行特異性、靈敏性和田間樣品驗(yàn)證等[21-22]深入研究，導(dǎo)致在生產(chǎn)中鮮見應(yīng)用RT-LAMP 檢測(cè)PLRV。因此，本研究建立PLRV 的RT-LAMP 檢測(cè)方法，優(yōu)化并驗(yàn)證檢測(cè)體系，以期為該病害的快速診斷、檢疫和制定防治措施等提供更好的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料 本試驗(yàn)所用PLRV、馬鈴薯X 病毒(potato virus X，PVX)、馬鈴薯Y 病毒(potato virus Y，PVY)、馬鈴薯S 病毒(potato virus S，PVS)、馬鈴薯A病毒(potato virus A，PVA)和馬鈴薯M 病毒(potato virus M，PVM)等的陽(yáng)性樣品、陰性對(duì)照是甘肅省馬鈴薯脫毒種薯(種苗)病毒檢測(cè)及安全評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室保存的離體組培苗；田間馬鈴薯樣本為采自甘肅省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的表觀健康和具有花葉、卷葉癥狀的植株葉片。

1.1.2 主要試劑 植物總 RNA 提取試劑盒(RNAprep Pure Plant Kit，DP432)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；RNA 酶抑制劑(RNasin Ribonuclease inhibitor)、M- MLV反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV Reverse Transcriptase)、重組Taq DNA聚合酶(rTaq DNA polymerase)、UNG 酶(uracil-N-glycosylase，UNG)、MgSO4、dNTP Mix 等購(gòu)自日本TaKaRa 公司；Bst 3.0 DNA Polymerase 購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs 公司；甜菜堿(Betaine)、SYBR Green Ι 等購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；焦炭酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)購(gòu)自美國(guó)Vetec 公司；GeneFinder TM 購(gòu)自廈門致善生物科技股份有限公司； 硝基四氮唑藍(lán)(nitrotetrazolium blue chloride，NBT)、瓊脂糖等購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；DAS-ELISA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Agdia公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 VORTEX-GENIE2/2T 漩渦混勻儀，美國(guó)Spectral Instruments 公司；iCEN-24 臺(tái)式高速離心機(jī)，杭州奧盛儀器有限公司；君意-JY600C 電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Tanon-3500R瓊脂凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；Nano Drop 2000 Spectrophotometer，美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司；T100TmThermal Cycler，美國(guó)Bio-Rad 公司；WHJ1 512d 智能控溫電熱水壺，美的集團(tuán)有限公司；SHA-C 型數(shù)顯水浴恒溫器，常州蒙特環(huán)境科技有限公司；11SC-1 筆式紫外燈，美國(guó)Spectronics 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒RNA 提取 1)參照植物總RNA 提取試劑盒的步驟提取病毒RNA。測(cè)定抽提的病毒RNA 總濃度后于-80℃保存?zhèn)溆谩?)病毒粒子直接吸附法(virion-direct absorbent，VDA)提取病毒RNA，參考杜志游[23]的方法進(jìn)行即時(shí)提取。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)GenBank 公布的PLRVCP基因序列(AY307123.1)，選擇保守區(qū)域ORF3 為靶標(biāo)基因，利用Primer Explorer 4.0 軟件(http:/ /primerexplorer.jp/elamp 4.0)在其6 個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)了多組RT-LAMP 引物；并結(jié)合Ju[20]和Ahmadi等[21]采用的2 組引物，經(jīng)多次試驗(yàn)篩選出擴(kuò)增效率最高的Pb 組引物(表1)，用于RT-LAMP 檢測(cè)。RTPCR 檢測(cè)方法引用SN/T 2627-2010[24]中的引物序列(表2)。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PLRV RT-LAMP 檢測(cè)引物Table1 Primers for PLRV detection by RT-LAMP

1.2.3 RT-LAMP 反應(yīng)體系 根據(jù)已報(bào)道的RTLAMP 反應(yīng)條件[25-26]確立初步反應(yīng)體系，然后采取單因素試驗(yàn)，篩選引物組、引物比例與濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間，以及Mg2＋、Betaine、Bst 3.0 DNA 聚合酶、dNTPs、UNG、SYBR Green Ι 濃度的多因素水平，最終反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[27]。

1.2.4 特異性驗(yàn)證 PLRV、PVX、PVY、PVS、PVM 和PVA 是馬鈴薯生產(chǎn)田中發(fā)生率較高、危害較嚴(yán)重的6 種主要病毒[1-2]，國(guó)家馬鈴薯種薯標(biāo)準(zhǔn)[5]規(guī)定必須檢測(cè)這6 種病毒。利用優(yōu)化的RT-LAMP 反應(yīng)體系對(duì)復(fù)合感染上述6 種馬鈴薯主要病毒的陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后，取RT-LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL 用2%瓊脂糖凝膠電泳分析；同時(shí)，另取擴(kuò)增產(chǎn)物加入1 μL 1 000× SYBR GreenⅠ，振蕩混勻，直接目視觀察結(jié)果，或加入1 μL 50× SYBR GreenⅠ，振蕩混勻，紫外線下觀察結(jié)果。采用RT-PCR 檢測(cè)方法進(jìn)行平行比對(duì)驗(yàn)證，RT-PCR 檢測(cè)按照標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2627-2010[24]的改進(jìn)方法進(jìn)行。RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳分析。

表2 PLRV RT-PCR 檢測(cè)引物Table2 Primers for PLRV detection by RT-PCR

1.2.5 RT-LAMP 靈敏度檢測(cè) 用無(wú)RNA 酶的水對(duì)陽(yáng)性樣品RNA 模板進(jìn)行10 倍梯度稀釋，制成100～108倍的9 個(gè)稀釋梯度，對(duì)不同稀釋梯度RNA 模板分別進(jìn)行RT-LAMP 和RT-PCR 檢測(cè)，比對(duì)二者的檢測(cè)靈敏度。RT-LAMP 和RT-PCR 檢測(cè)方法同1.2.4。

1.2.6 田間樣品檢測(cè)驗(yàn)證 為檢驗(yàn)該技術(shù)在生產(chǎn)中應(yīng)用的可行性，田間采集表觀健康和具有花葉、卷葉癥狀的疑似病毒病的馬鈴薯植株葉片樣本90 個(gè)，應(yīng)用ELISA、RT-PCR 和RT-LAMP 3 種方法進(jìn)行檢測(cè)。每種方法設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。待檢測(cè)樣本RNA采用VDA 法提取[23]。利用數(shù)顯水浴恒溫器和智能控溫電熱水壺提供反應(yīng)所需的62℃恒溫條件。ELISA按照GB 18133-2000[5]進(jìn)行，RT-PCR 和RT-LAMP 檢測(cè)方法同1.2.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-LAMP 體系的建立

應(yīng)用本研究建立的RT-LAMP 反應(yīng)體系擴(kuò)增PLRV，能產(chǎn)生LAMP 產(chǎn)物特殊的階梯狀條帶，而空白對(duì)照和陰性對(duì)照不產(chǎn)生條帶，RT-LAMP 檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR 一致(圖1-A、B)。RT-LAMP 反應(yīng)產(chǎn)物中加入高濃度(1 000×)SYBR Green Ι 后，陽(yáng)性樣品顏色變?yōu)榫G色，陰性對(duì)照顏色為褐色(圖1-C)，加入低濃度(50×)SYBR Green Ι 后，紫外線下(筆式紫外燈)陽(yáng)性樣品發(fā)出強(qiáng)熒光，陰性對(duì)照不發(fā)熒光(圖1-D)。因此，RT-LAMP 檢測(cè)可通過(guò)肉眼觀察直接判斷結(jié)果，較RT-PCR 簡(jiǎn)單容易。

圖1 PLRV RT-LAMP 檢測(cè)體系Fig.1 Detection system for PLRV by RT-LAMP

2.2 特異性驗(yàn)證

PLRV 陽(yáng)性對(duì)照和已知感染PLRV 的復(fù)合感染樣品(2～6 泳道)經(jīng)RT-LAMP 檢測(cè)均顯示陽(yáng)性，陰性對(duì)照和未感染PLRV 但復(fù)合感染其他種類病毒的樣品(7和8 泳道)均顯示陰性，表明該方法與其他5 種馬鈴薯主要病毒(PVX、PVY、PVS、PVA 和PVM)不發(fā)生交叉反應(yīng)，只特異性擴(kuò)增PLRV?？梢暬凶x，PLRV 陽(yáng)性樣本反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，顯示為陽(yáng)性，而陰性和未感染PLRV 的樣本反應(yīng)液顏色為褐色，顯示為陰性；紫外線下有著相同的判讀結(jié)果(圖2)?？梢?，建立的RTLAMP 體系對(duì)PLRV 檢測(cè)具有特異性。

圖2 RT-LAMP 特異性檢測(cè)Fig.2 Specificity of detection system for PLRV by RT-LAMP

2.3 靈敏度檢測(cè)

靈敏度檢測(cè)結(jié)果顯示，RT-LAMP 可檢測(cè)到104倍的稀釋PLRV 陽(yáng)性RNA 模板(2～6 泳道)，而常規(guī)RTPCR 只能檢測(cè)到102倍的PLRV 陽(yáng)性RNA 稀釋模板(2～4 泳道)，表明RT-LAMP 靈敏度是RT-PCR 的102倍(圖3)。經(jīng)計(jì)算RT-LAMP 技術(shù)可檢測(cè)的最小RNA濃度為5×10-3ng·μL-1。RT-LAMP 產(chǎn)物中添加SYBR GreenⅠ染料后，陰性對(duì)照為褐色，陽(yáng)性樣品呈綠色，且隨著PLRV 陽(yáng)性樣品RNA 稀釋倍數(shù)的增加顏色變得不易區(qū)分，但在紫外線下很容易辨別(圖3-C、D)。因此，可利用紫外照射提高可視化判讀的可靠性。

圖3 RT-LAMP 和RT-PCR 檢測(cè)PLRV 靈敏度對(duì)比結(jié)果Fig.3 Comparison of sensitivity of RT-LAMP and RT-PCR for the detection of PLRV

2.4 田間樣品檢測(cè)驗(yàn)證

應(yīng)用ELISA、RT-PCR 和RT-LAMP 3 種檢測(cè)方法對(duì)田間采集的90 個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，ELISA檢測(cè)出30 個(gè)PLRV 陽(yáng)性樣品(圖4)，RT-LAMP 和RTPCR 均檢測(cè)出28 個(gè)PLRV 陽(yáng)性樣品(包含在ELISA檢出的30 個(gè)陽(yáng)性樣品中)，二者檢測(cè)方法結(jié)果一致，符合率為100%(圖5-A、B，結(jié)果未全部顯示)。采用上述3 種檢測(cè)方法對(duì)ELISA 多檢出的2 個(gè)陽(yáng)性樣品進(jìn)行復(fù)檢，結(jié)果3 種檢測(cè)方法一致判定為陰性，可見，ELISA 檢測(cè)有時(shí)存在個(gè)別的假陽(yáng)性誤判。樣品2、10、11 和17 在RT-PCR 檢測(cè)中電泳條帶比較弱，而在RTLAMP 檢測(cè)中電泳條帶明顯，說(shuō)明RT-LAMP 方法較RT-PCR 具有較高的靈敏度。可視化顏色變化結(jié)果與電泳檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)一致(圖5-C)。此外，利用數(shù)顯水浴恒溫器和智能控溫電熱水壺替代PCR 儀控溫，能夠達(dá)到該技術(shù)對(duì)恒溫的要求。因此，本研究建立的RTLAMP 技術(shù)可應(yīng)用于田間樣品快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)與診斷。

圖4 90 個(gè)田間樣品PLRV 的ELISA 檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The result of PLRV detection of ninty field samples by ELISA

圖5 田間樣品PLRV 的RT-PCR 和RT-LAMP 檢測(cè)結(jié)果Fig.5 PLRV detection of field samples by RT-PCR and RT-LAMP

3 討論

設(shè)計(jì)引物和篩選合適的引物是建立穩(wěn)定RTLAMP 反應(yīng)體系的關(guān)鍵。前期研究引用文獻(xiàn)引物2套[20-21]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2 套引物擴(kuò)增不穩(wěn)定，可能是引物的識(shí)別、匹配和定位限制因素以及反應(yīng)體系的穩(wěn)定性造成的[13]，也可能是因?yàn)槿鄙侪h(huán)引物加速，擴(kuò)增效率相對(duì)較低。為了獲得快速、高效、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的檢測(cè)PLRV 的RT-LAMP 反應(yīng)體系，選擇PLRVCP基因保守序列ORF3，針對(duì)6 個(gè)不同區(qū)域片段設(shè)計(jì)6 條引物，共設(shè)計(jì)了8 組引物，經(jīng)多次反復(fù)試驗(yàn)，篩選新設(shè)計(jì)的Pb 組引物，該組引物擴(kuò)增效率高特異性強(qiáng)，在62℃恒溫下擴(kuò)增50 min，擴(kuò)增結(jié)束后可視化判讀樣品是否感染PLRV。

可通過(guò)比較檢測(cè)目的病毒特異性擴(kuò)增，而非目的病毒不擴(kuò)增的方法進(jìn)行RT-LAMP 檢測(cè)技術(shù)的特異性驗(yàn)證。王永江等[25]利用常見的柑橘碎葉病毒、柑橘裂皮病毒、柑橘黃龍病毒和柑橘潰瘍病毒的陽(yáng)性樣品，對(duì)建立的柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus，CTV) RTLAMP 檢測(cè)方法的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)該方法對(duì)CTV 檢測(cè)具有特異性；張永江等[26]以同樣侵染葡萄的沙地葡萄莖痘病毒、葡萄卷葉病毒、葡萄斑點(diǎn)病毒對(duì)葡萄A 病毒(grapevine virusa，GVA) RT-LAMP 方法的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，得出所建立的GVA RT-LAMP方法對(duì)CTV 檢測(cè)具有特異性。本研究采用PLRV 與PVX、PVY、PVS、PVA 和PVM 等5 種主要馬鈴薯病毒交叉復(fù)合感染的陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，建立的PLRV RT-LAMP 檢測(cè)方法，不與PVX、PVY、PVS、PVM和PVA 等病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng)，具有很好的特異性。可視化結(jié)果判讀，SYBR Green Ι 陰性與陽(yáng)性顏色對(duì)比明顯，特異性效果顯著。

關(guān)于RT-LAMP 的靈敏度研究發(fā)現(xiàn)，LAMP 能從極低微量的拷貝中擴(kuò)增出目的基因，較傳統(tǒng)PCR 至少高出一個(gè)數(shù)量級(jí)[18]。本研究RT-LAMP 技術(shù)靈敏度是RT-PCR 技術(shù)靈敏度的100 倍，這與前人利用RTLAMP 技術(shù)檢測(cè)柑橘衰退病毒[25]和草莓輕型黃邊病毒[28]的研究結(jié)果相同。Le 等[29]和張永江[26]等利用該技術(shù)分別檢測(cè)水稻條紋病毒RSV、葡萄A 病毒，其靈敏度均比RT-PCR 高10 倍。而周彤等[30]建立的水稻黑條矮縮病毒RT-LAMP 快速檢測(cè)方法，可檢測(cè)稀釋104病毒樣本RNA，靈敏度與RT-PCR 基本一致。RT-LAMP 技術(shù)的靈敏度在不同試驗(yàn)中差別較大，可能是由擴(kuò)增效率造成。擴(kuò)增效率與所用引物的質(zhì)量和特性有關(guān)，如引物的長(zhǎng)度、退火溫度、GC 含量等都會(huì)影響引物的結(jié)合率和反應(yīng)的擴(kuò)增效率，還可能與反應(yīng)體系中酶活性、化學(xué)組分及其濃度等有關(guān)[25]。

本研究基于LAMP 技術(shù)簡(jiǎn)便省時(shí)、特異性強(qiáng)、靈敏度高、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低廉以及結(jié)果可視化判讀等優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了RT-LAMP 檢測(cè)技術(shù)，使其應(yīng)用更加簡(jiǎn)便。第一，病毒核酸提取技術(shù)簡(jiǎn)化。利用試劑盒提取病毒RNA，需要專業(yè)的操作技術(shù)。本研究嘗試?yán)靡环N技術(shù)要求低、簡(jiǎn)單快速、可在基層簡(jiǎn)陋實(shí)驗(yàn)室完成操作的抽提馬鈴薯病毒RNA 的方法，即VAD 法，成功用于RT-PCR 和RT-LAMP 擴(kuò)增檢測(cè)和結(jié)果可視化判讀。第二，使用便攜式恒溫控制設(shè)備。RT-LAMP 檢測(cè)反應(yīng)在恒溫62℃左右進(jìn)行，可用水浴鍋或保溫杯代替PCR 儀進(jìn)行控溫。本研究中田間樣本RT-LAMP 檢測(cè)試驗(yàn)，利用數(shù)顯水浴恒溫器和智能控溫電熱水壺控溫，RT-LAMP 結(jié)果均與RT-PCR 對(duì)應(yīng)一致，實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單電熱設(shè)備替代PCR 儀滿足該技術(shù)對(duì)恒溫的要求。第三，在擴(kuò)增產(chǎn)物可視化判讀研究中，SYBE Green Ι 能結(jié)合到雙鏈DNA 的小溝部位，引起明顯的顏色變化，但肉眼判讀須使用較高濃度SYBE Green Ι。本研究為降低成本，使用低濃度SYBR Green Ι，利用便攜式筆式紫外燈照射，根據(jù)熒光強(qiáng)度變化進(jìn)行結(jié)果判讀。

4 結(jié)論

本研究建立的可視化PLRV RT-LAMP 檢測(cè)方法，在62℃恒溫下擴(kuò)增50 min，擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR Green Ι，陽(yáng)性樣品顏色變?yōu)榫G色，陰性樣品顏色仍為褐色，可直接目測(cè)判斷待檢測(cè)樣品是否感染PLRV。該方法可檢測(cè)到104倍的稀釋PLRV 陽(yáng)性RNA 模板，靈敏度是RT-PCR 的102倍。利用VAD 法提取PLRV RNA，成功實(shí)現(xiàn)PLRV RT-LAMP 擴(kuò)增；利用數(shù)顯水浴恒溫器或智能控溫電熱水壺替代PCR 儀，完全滿足RT-LAMP 恒溫?cái)U(kuò)增的控溫要求；利用便攜式筆式紫外燈照射加強(qiáng)了可視化的結(jié)果判讀，降低了SYBR Green Ι 用量，節(jié)約了成本。簡(jiǎn)便化的RT-LAMP 檢測(cè)技術(shù)該方法，具有便捷、靈敏、特異、快速、成本低和技術(shù)要求低等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際檢測(cè)中展示出良好的應(yīng)用前景，可滿足科研、基層單位對(duì)該病毒快速診斷和檢測(cè)的需要。