徐 迪 馬 康 單吉浩 李建勛

(1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；2中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100029)

鎮(zhèn)靜劑類藥物是一類通過(guò)抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)減弱其生理機(jī)能而達(dá)到緩和激動(dòng)、消除躁動(dòng)、恢復(fù)安靜情緒的藥物[1-2]。近年來(lái)，有些不法畜牧業(yè)主為了追求經(jīng)濟(jì)利益最大化，在畜禽飼料中違法添加鎮(zhèn)靜劑類藥物，以達(dá)到降低動(dòng)物運(yùn)動(dòng)量和增重催肥的目的[3]。此外，在動(dòng)物運(yùn)輸過(guò)程中也常常使用此類藥物來(lái)減少動(dòng)物體重下降以及防止肉品質(zhì)降低[4-5]。非法使用鎮(zhèn)靜劑類藥物會(huì)導(dǎo)致藥物殘留在各種動(dòng)物源食品中，食用此類食品會(huì)對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生較大的危害[6]。目前，國(guó)際食品法典委員會(huì)(codex alimentarius commission，CAC)、歐盟、澳大利亞等國(guó)家或組織均對(duì)畜肉中鎮(zhèn)靜劑的最高限量值做出了相關(guān)規(guī)定[7]。我國(guó)則將鎮(zhèn)靜劑類藥物列為禁用藥物，規(guī)定動(dòng)物源食品中不得檢出此類藥物[8-9]。

目前，鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)法[10]、高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC) 法[11-14]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(gas chromatography-tandem mass spectrometery，GC-MS/MS)法[15-18]和超高液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatogram-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)法[19-25]。其中ELISA 法檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；HPLC 法靈敏度低，且色譜峰易受到各種基質(zhì)成分的干擾，易造成定量不準(zhǔn)確；GCMS/MS 法需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，導(dǎo)致檢測(cè)周期長(zhǎng)；而UPLC-MS/MS 法可以彌補(bǔ)前幾種方法的缺陷，該技術(shù)無(wú)需衍生化處理，且其選擇性高、靈敏度高、特異性強(qiáng)。已有針對(duì)動(dòng)物源性食品和血液中鎮(zhèn)靜劑類藥物檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道[26-27]，然而對(duì)動(dòng)物尿液中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留檢測(cè)方法的報(bào)道較少。因此，本試驗(yàn)采用UPLC-MS/MS技術(shù)，以期建立豬、牛、羊尿液中5 種常見(jiàn)鎮(zhèn)靜劑類藥物異丙嗪亞砜、異丙嗪、氯丙嗪、安眠酮和地西泮殘留的測(cè)定方法，為我國(guó)相關(guān)監(jiān)管部門提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

豬尿、牛尿、羊尿取自于河北、天津、海南三省的生豬、生牛和生羊屠宰場(chǎng)。

異丙嗪亞砜、異丙嗪、氯丙嗪、安眠酮和地西泮標(biāo)準(zhǔn)品，天津阿爾塔科技有限公司；甲醇、乙腈(質(zhì)譜純)，美國(guó)Fisher 公司；甲酸、乙酸(色譜級(jí))，美國(guó)Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple Quad 6495 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司；3K15 離心機(jī)，美國(guó)Sigma 公司；Vortex-genie 2 渦旋混合器，德國(guó)IKA 公司；AG245 分析天平，瑞士Metler Toledo 公司；DSY-Ⅲ水浴型氮吹儀，北京東方精華苑科技有限公司；Oasis MCX 固相萃取柱(3 mL，60 mg)，美國(guó)Waters 公司；Milli-Q 純水儀，美國(guó)Millipore公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制 分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg 氯丙嗪、異丙嗪、安眠酮、異丙嗪亞砜和地西泮標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解、定容、混勻，配制成1.0 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。精密量取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于容量瓶中，甲醇定容，配制成10.0 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，再用甲醇將其稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以上標(biāo)準(zhǔn)溶液均避光-18℃保存。

1.3.2 樣品前處理 準(zhǔn)確量取2.0±0.05 mL 尿液(豬尿、牛尿、羊尿)于50 mL 具塞離心管中，8 000 r·min-1離心5 min，上清液用5%乙酸水溶液調(diào)pH 值至3.0，然后過(guò)Oasis MCX 柱凈化:首先依次用3 mL甲醇和3 mL 水對(duì)MCX 柱進(jìn)行預(yù)處理，然后將上清液加載在MCX 小柱上，再依次用3 mL 水和3 mL 40%甲醇水溶液洗柱，棄去淋洗液，真空抽干MCX 小柱1 min，取3 mL 5%氨化甲醇進(jìn)行洗脫，洗脫液在45℃條件下氮?dú)饬鞔蹈桑尤? mL 0.1%甲酸溶液/乙腈(v/v，8/2)溶解復(fù)溶，過(guò)0.22 μm 濾膜，供UPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.3.3 色譜條件 色譜柱:Agilent Poroshell 120ECC18 柱(50 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相A:0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B:乙腈；梯度洗脫條件:0～1.0 min，90% A；5.0 min，25% A；5.5 ～6.0 min，15% A；7.0 ～8.0 min，1% A；9.0 ～10.0 min，90%A；柱溫:45℃；流動(dòng)相流速:0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量:10 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧電離源(ESI)；掃描方式:正離子掃描；檢測(cè)方式:多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)；毛細(xì)管電壓:2.5 kV；噴嘴電壓:2.0 kV；干燥氣溫度:200℃；錐孔反吹氣流速:50 L·h-1；脫溶劑氣溫度和流量分別為380℃和660 L·h-1；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量見(jiàn)表1。

1.3.5 方法學(xué)考察及基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià) 取不含待測(cè)藥物的豬尿、牛尿、羊尿的空白基質(zhì)，添加濃度分別為0.6、2.5 和9.0 μg·L-1的鎮(zhèn)靜劑類藥物，按1.3.2 方法處理后，按1.3.3 色譜條件進(jìn)行樣品分析，每個(gè)濃度重復(fù)5 次，考察回收率與精密度；分別以3 倍、10 倍信噪比(signal-noise ratio，S/N)計(jì)算檢出限和定量限:5 種鎮(zhèn)靜劑類藥物在豬尿、牛尿和羊尿中受到的基質(zhì)效應(yīng)根據(jù)其在濃度為2.5 μg·L-1的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液和同等濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中的響應(yīng)比值來(lái)計(jì)算，即基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)＝(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液在儀器上的響應(yīng)值-溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液在儀器上的響應(yīng)值)/溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液在儀器上的響應(yīng)值×100%[28]。根據(jù)ME 值可將其分為三類:ME＜-20%定義為基質(zhì)抑制效應(yīng)；-20%≤ME≤20%定義為弱基質(zhì)效應(yīng)；ME>20%定義為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0 以及Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析，采用Origin 8.6 軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

歐盟規(guī)定對(duì)于禁用獸藥殘留定性確證的要求，至少需要4 個(gè)確證點(diǎn)。本試驗(yàn)選擇每個(gè)獸藥的母離子和對(duì)應(yīng)的兩個(gè)響應(yīng)較高的子離子進(jìn)行定性，一個(gè)母離子和一個(gè)子離子分別為1 個(gè)和1.5 個(gè)確證點(diǎn)，共4 個(gè)確證點(diǎn)，滿足定性要求。兩個(gè)子離子中豐度高的最為定量離子，并通過(guò)一系列碰撞能量條件優(yōu)化，確定5 種鎮(zhèn)靜劑類獸藥串聯(lián)質(zhì)譜分析的最佳碰撞能量。5 種鎮(zhèn)靜劑類獸藥的定性和定量離子對(duì)以及碰撞能量等參數(shù)見(jiàn)表1。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)可分為對(duì)分析物信號(hào)響應(yīng)的增強(qiáng)效應(yīng)、弱基質(zhì)效應(yīng)和抑制效應(yīng)，最終會(huì)影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性[29]。由表2可知，5 種鎮(zhèn)靜劑類藥物在3 種尿樣均顯示出弱基質(zhì)效應(yīng)，更多地顯示出弱基質(zhì)抑制效應(yīng)。這可能是由于尿液中雜質(zhì)成分與目標(biāo)分析物競(jìng)爭(zhēng)性進(jìn)入離子源被檢測(cè)，導(dǎo)致弱基質(zhì)抑制效應(yīng)。綜上，基質(zhì)效應(yīng)不顯著，對(duì)定量結(jié)果的影響較小，因此可直接采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液代替基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量分析，從而降低實(shí)驗(yàn)周期，提高檢測(cè)效率。

表1 5 種鎮(zhèn)靜劑的定性、定量離子對(duì)和最佳碰撞能量Table1 Quantitative and qualitative ions，and optimized collision energies for the five sedatives

表2 不同尿樣中5 種鎮(zhèn)靜劑藥物的基質(zhì)效應(yīng)Table2 ME for the five sedatives in different urine samples/%

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線形范圍、檢出限和定量限 用甲醇稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制成0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 和20.0 μg·L-1系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，μg·L-1)，其定量離子色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表3。5 種鎮(zhèn)靜劑在0.6～20.0 μg·L-1內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2) 均大于0.993。5 種鎮(zhèn)靜劑類藥物檢出限均為0.1 μg·L-1，定量限均為0.6 μg·L-1，證實(shí)該方法靈敏度高，可滿足日常檢測(cè)需要。

2.3.2 方法的準(zhǔn)確度與精密度 本試驗(yàn)通過(guò)豬尿、牛尿和羊尿加標(biāo)回收試驗(yàn)對(duì)方法準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)，各藥物的回收率和精密度見(jiàn)表4。結(jié)果表明，5 種鎮(zhèn)靜劑藥物的平均回收率為64.6%～110.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏 差(relative standard deviation，RSD) 均小于6.0%，證實(shí)本方法具有很好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

隨機(jī)抽取屠宰場(chǎng)中豬、牛、羊尿各15 份，采用本試驗(yàn)建立的方法和中國(guó)檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法[27]分別對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，均未檢測(cè)出5 種鎮(zhèn)靜劑藥物殘留，證實(shí)該方法是準(zhǔn)確、可靠的。

表3 5 種鎮(zhèn)靜劑類藥物的線性范圍、檢出限與定量限Table3 Linear ranges，limit of detection and limit of quantitation of five sedatives

表4 豬尿、牛尿和羊尿中5 種鎮(zhèn)靜劑藥物準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n＝5)Table4 Average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the five sedatives in pig urine，cow urine and sheep urine (n＝5)

3 討論

本研究采用UPLC-MS/MS 法測(cè)定5 種鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留，省略了采用氣相色譜法檢測(cè)所必需的衍生化過(guò)程，很大程度縮短了試驗(yàn)周期。已有研究表明，采用UPLC-MS/MS 法能夠有效測(cè)定動(dòng)物源食品的鎮(zhèn)靜劑類藥物[6]，但針對(duì)不同樣品的基質(zhì)、凈化和提取條件差異較大。朱群英等[1]在檢測(cè)豬肉樣品中鎮(zhèn)靜劑類藥物時(shí)，以乙酸乙酯為提取劑，經(jīng)Oasis HLB 固相萃取柱凈化后，鎮(zhèn)靜劑類藥物回收率為88.5% ～115.0%。劉家陽(yáng)等[7]選取鹽酸溶液提取畜肉中的鎮(zhèn)靜劑類藥物，經(jīng)MCX 固相萃取凈化后，鎮(zhèn)靜劑類藥物回收率為71.6%～112.0%；本研究利用Oasis MCX 固相萃取小柱凈化，UPLC-MS/MS 分析測(cè)定豬、牛、羊尿中5 種鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留含量，其回收率為64.6%～110.2%，符合殘留檢測(cè)要求。但與孟蕾等[2]的研究結(jié)果相比，本研究測(cè)定的鎮(zhèn)靜劑類藥物回收率范圍較大，其原因可能是本試驗(yàn)測(cè)定不同動(dòng)物源尿液樣品中含有的物質(zhì)有一定差異性，同一種固相萃取小柱對(duì)不同尿液凈化能力不同，導(dǎo)致回收率范圍較寬。因此，在今后的工作中，可針對(duì)不同動(dòng)物尿液自身的特性，對(duì)多種不同的提取溶劑和凈化小柱進(jìn)行考察，開(kāi)展多樣的提取和凈化條件篩選工作。

本研究利用乙腈對(duì)動(dòng)物尿液中鎮(zhèn)靜劑類藥物進(jìn)行提取，采用固相萃取柱去除尿液中雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，步驟操作簡(jiǎn)單，且針對(duì)動(dòng)物尿液這類相對(duì)比較簡(jiǎn)單的基質(zhì)，通過(guò)基質(zhì)效應(yīng)考察發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)效應(yīng)并不明顯，故可以直接采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量分析，從而省略了每批樣品配置基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的繁雜步驟，整個(gè)前處理過(guò)程在10 min 內(nèi)即可完成，實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物尿液中鎮(zhèn)靜劑類獸藥殘留的快速檢測(cè)。國(guó)標(biāo)方法[30]是在堿性條件下利用特丁基甲醚對(duì)基質(zhì)中鎮(zhèn)靜劑類藥物進(jìn)行提取，前處理過(guò)程涉及水浴和多次提取的步驟，前處理過(guò)程約2.5 h，儀器檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1 h，是該方法儀器檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)的6 倍。因此，本研究的分析方法具有速度快、靈敏度高和重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，可適用于大批量的不同動(dòng)物尿液中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留的快速檢測(cè)。

4 結(jié)論

本研究采用固相萃取柱凈化方式，建立了UPLCMS/MS 法測(cè)定動(dòng)物尿樣中5 種鎮(zhèn)靜劑類獸藥殘留的檢測(cè)方法，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，因此采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線定量。采用該方法對(duì)豬、牛、羊尿中的5 種鎮(zhèn)靜劑獸藥殘留檢測(cè)顯示出良好的萃取效果，加標(biāo)回收率在64.6%～110.2%之間，RSD 均小于6.0%，定量限為0.6 μg·L-1，該方法準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好，靈敏度高，各項(xiàng)指標(biāo)均能滿足豬、牛、羊尿中鎮(zhèn)靜劑類獸藥殘留檢測(cè)分析的要求，可為不同動(dòng)物尿液中鎮(zhèn)靜劑類藥物的常規(guī)檢測(cè)提供有力幫助。