陳麗華 楊喜盟 賈 昊 宋麗華

(寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021)

全球氣候變暖已成為近百年來全球氣候變化的主要特征[1]。據預測，21世紀末氣溫還將升高1.5 ～4.5℃[2-4]。有專家認為，隨著氣候的變暖，土壤水分蒸發(fā)量相應增加，西北地區(qū)的氣候將向干熱方向演化，干旱程度將會加重[5]。在此局勢下，近50 多年來，寧夏氣溫也逐年升高，降水量總體呈下降趨勢[6-8]，氣溫升高與干旱加劇現象十分明顯[9]。

靈武長棗(Ziziphus jujubaMill cv. Lingwu changzao)又名馬牙棗，屬鼠李科棗屬，是寧夏特色經濟林優(yōu)良鮮食棗品種，果實富含維生素C 和多種氨基酸，兼具藥食同源的特性，有顯著的生態(tài)、社會與經濟效益[10-12]。靈武長棗果實中糖的種類和含量直接影響果實的營養(yǎng)價值、風味口感、色澤等品質性狀，而溫度、水分、光照等環(huán)境因子又影響果實的糖代謝[13-15]。目前，對于蘋果[16]、獼猴桃[17]、葡萄[18]等果實糖積累、蔗糖代謝關鍵酶及相關基因表達已有研究，但鮮見有關對棗的研究報道。對靈武長棗的研究主要集中于產業(yè)化生產和鮮果保鮮、生物學特性、種質資源調查和品種選優(yōu)等方面[18-19]，對果實品質形成的原因仍缺少深入而系統(tǒng)的研究，在果實發(fā)育過程中糖的積累規(guī)律及其酶學機理方面的研究也相對較少。本試驗通過測定大氣升溫與土壤干旱交互處理下不同發(fā)育時期靈武長棗果實的糖積累、蔗糖代謝關鍵酶及相關基因表達水平，揭示氣溫升高與干旱交互作用下靈武長棗果實糖分積累、蔗糖代謝關鍵酶及基因表達水平的變化規(guī)律，闡明三者之間的關系，并從分子水平探究其影響機制，旨在為寧夏靈武長棗生產實踐應對全球氣候變化提供理論指導與科技支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗地概況

以6年生靈武長棗嫁接苗為試驗對象，試驗于2018年4月底至10月初在寧夏大學實驗農場進行。試驗地位于寧夏永寧縣(38°47′07″N，106°04′00″E，海拔1 116.8 m)，屬中溫帶干旱氣候區(qū)，年均氣溫8.5℃，年均日照時數3 000 h，日溫差13℃，年均≥10℃積溫3 300℃，無霜期140～160 d，年降水量180 ～200 mm，土壤為灌淤土[20]。

1.2 試驗設計

采用大氣溫度和土壤含水量雙因素完全區(qū)組試驗設計。大氣溫度設置2 個水平:自然環(huán)境大氣溫度(T1)，升高大氣溫度(T2)，T2 溫度為T1 ＋(2.0±0.5℃)；土壤含水量設置3 個梯度:正常土壤供水(D1，田間最大持水量的70%～75%)，中度干旱(D2，田間最大持水量的50%～55%)，重度干旱(D3，田間最大持水量的30%～35%)。共6 個處理，以D1T1 為對照(CK)。每處理3 次重復，共18 棵樣株。于棗樹萌芽期開始同時進行氣溫升高與干旱處理，至棗果成熟后結束。

采用自制開頂氣室模擬大氣升溫環(huán)境。開頂氣室由口徑為4 cm×4 cm 的鍍鋅方管框架和無色透明棚膜組成，氣室高2.3 m，底部邊長2 m×2 m，四周圍繞無色透明棚膜，形成四棱柱形開頂氣室。對升溫處理樣株套蓋開頂氣室，常溫處理樣株套蓋通透型開頂氣室，確?？諝鈱α骷皻馐覂韧獯髿鉁囟纫恢?。氣室內大氣溫度采用ZWSN-C-A 紫藤科技系列農用溫室型多路無線數據采集設備(天津紫藤科技股份有限公司)完成自動實時監(jiān)測和記錄。每處理樣株的土壤含水量控制采用塑料地膜進行水分隔離，沿著植株樹干四周直徑1.5 m 處，開溝深度為80 cm，用塑料地膜進行水分隔離，以保持各處理土壤含水量。采用GG-001B 單頭有線太陽能自動灌溉系統(tǒng)(上海艾美克電子有限公司)進行土壤含水量監(jiān)測與控制。

試驗期間，T2 環(huán)境的溫度變化曲線與T1 具有相似的趨勢(圖1)，總體均呈先上升后下降的趨勢。

圖1 不同溫度控制下氣溫變化Fig.1 Temperature changes under different temperature control

試驗期間，不同干旱程度下土壤含水量變化如圖2所示，各干旱處理(D1、D2、D3)土壤含水量在果實生長發(fā)育不同時期存在一定波動，但范圍較小。D1 的土壤水分含量為19.00%～20.50%，其預值設為19%～20%；D2 的土壤水分含量為13.80%～15.00%，其預設值為14% ～15%；D3 的土壤水分含量為8.00% ～10.00%，其預設值為8%～9%。

圖2 不同干旱程度下土壤含水量變化Fig.2 Changes of soil water content under different drought levels

分別于果實發(fā)育不同時期采集樣株樹冠東、西、南、北及上、中、下、里、外9 個方向的棗吊基部第二節(jié)處同一批開花結果無病蟲害果實(約20 個)。將每處理重復樣株果實混合均勻后分成兩份，一份迅速放入液氮罐中帶回，保存于-80℃冰箱用于蔗糖代謝關鍵酶活性及相關基因表達量的測定；另一份保存于4℃冰箱用于糖含量的測定。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 可溶性糖、淀粉含量的測定 用蒽酮比色法測定靈武長棗果實的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉含量[21-22]。

1.3.2 蔗糖代謝關鍵酶活性的測定 酸性轉化酶(acid invertase，AI)、中性轉化酶(neutral invertase，NI)、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthetase，SPS)、蔗糖合成酶合成方向(synthesis direction of sucrose synthetase，SS-s) 和蔗糖合成酶分解方向(direction activity of sucrose synthetase，SS-c)活性的測定參考文獻[23-27]的方法。

1.3.3 蔗糖代謝關鍵酶基因相對表達量的測定 取試驗樣品500 mg，采用改良CTAB 法[28]提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 質量(A260/A280)，利用cDNA Synthesis Kit Probegene MM061 試劑盒(江蘇溥博生物科技有限公司)反轉錄cDNA。以ZjActin作為內參基因，內參及目的基因引物設計均交由Probegene公司(北京)完成，然后由上海生工合成。以合成的cDNA 為模板進行PCR 反應，反應體系:10 μL 模板cDNA，0.1 μL 上、下游引物，5 μL 2× SYBR Green qPCR Master Mix。反應程序:95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，運行40 個循環(huán)后72℃延伸7 min，最后4℃終止反應。采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量，采用Heat map illustrator 對基因相對表達量進行制圖。

1.4 數據分析

采用Excel 2016 對原始數據進行整理。果實糖含量數據在進行方差分析前進行反正弦轉換。采用SPSS 25.0 進行雙因素方差分析與各處理間差異顯著性檢驗(Duncan 新復極差法)，采用Origin 2018 制圖。

2 結果與分析

2.1 氣溫升高與干旱對靈武長棗果實糖含量的影響

2.1.1 對果實葡萄糖含量的影響 由表1可知，相同土壤含水量水平下，T2 果實成熟期葡萄糖含量均高于T1，表明氣溫升高增加了果實葡萄糖含量。同一大氣溫度環(huán)境中，不同土壤含水量水平下果實成熟期葡萄糖含量均表現為D2>D1>D3，表明中度干旱增加了果實葡萄糖含量，重度干旱減少了果實葡萄糖含量；與D1 相比，D2 果實葡萄糖含量在成熟期分別增加了0.71(T1)和0.83(T2)個百分點，D3 分別降低了1.90(T1)和2.73(T2)個百分點。表明氣溫升高增強了中度干旱對果實葡萄糖積累的促進作用，加劇了重度干旱對果實葡萄糖積累的抑制作用。

表1 氣溫升高與干旱對靈武長棗果實葡萄糖含量的影響Table1 Effect of elevated temperature and drought on glucose content in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzao /%

2.1.2 對果實果糖含量的影響 由表2可知，在土壤含水量水平為D1 和D2 時，T2 果實果糖含量整體較T1 升高，而在土壤含水量水平為D3 時降低，表明氣溫升高增加了正常土壤供水和中度干旱條件下果實果糖含量，但減少了重度干旱下果實果糖含量。T1 中，不同土壤含水量水平下果實果糖含量除著色后期均表現為D3>D2>D1，表明干旱增加了果實果糖含量；2 種大氣溫度環(huán)境中，與D1 相比，D2 和D3 在著色中期果實果糖含量分別增加0.66 和1.62(T1)、0.67 和0.69(T2)個百分點。表明氣溫升高增強了干旱對果實果糖積累的促進作用。

2.1.3 對果實蔗糖含量的影響 由表3可知，相同土壤含水量水平下，除幼果期外，T2 果實蔗糖含量均高于T1，表明氣溫升高增加了果實蔗糖含量。同一大氣溫度環(huán)境中，不同土壤含水量水平下成熟期果實蔗糖含量均表現為D2>D1>D3，表明中度干旱條件下更有利于果實蔗糖的積累；與D1 相比，D2 和D3 果實著色中期蔗糖含量分別增加了4.51 和4.62(T1)、2.20 和1.19(T2)個百分點。表明氣溫升高減緩了干旱對果實蔗糖積累的促進作用。

表2 氣溫升高與干旱對靈武長棗果實果糖含量的影響Table2 Effect of elevated temperature and drought on fructose content in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzo /%

表3 氣溫升高與干旱對靈武長棗果實蔗糖含量的影響Table3 Effect of elevated temperature and drought on sucrose content in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzo /%

2.1.4 對果實淀粉含量的影響 由表4可知，相同土壤含水量水平下，T2 果實淀粉含量均高于T1，表明氣溫升高增加了果實淀粉含量。同一大氣溫度環(huán)境中，不同土壤含水量水平下果實淀粉含量在膨大期、著色初期和著色后期均表現為D3>D1>D2，表明重度干旱增加了果實淀粉含量，而中度干旱降低了果實淀粉含量；與D1 相比，D2 果實淀粉含量在成熟期分別降低了0.05 和0.05(T1 和T2)個百分點，而D3 分別增加了0.08 和0.10(T1 和T2)個百分點。表明氣溫升高增強了重度干旱對果實淀粉積累的促進作用。

表4 氣溫升高與干旱對靈武長棗果實淀粉含量的影響Table4 Effect of elevated temperature and drought on starch content in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzo /%

2.2 氣溫升高與干旱對靈武長棗果實蔗糖代謝關鍵酶活性的影響

2.2.1 對AI 活性的影響 由表5可知，相同土壤含水量水平下，T1 果實AI 活性均高于T2，表明氣溫升高降低了果實的AI 活性。同一大氣溫度環(huán)境中，不同土壤含水量水平下果實AI 活性在幼果期、著色初期和著色后期均表現為D2>D1>D3，表明中度干旱提高了果實AI活性，而重度干旱降低了果實AI 活性；與D1 相比，D2果實AI 活性在成熟期分別增加了8.62%和9.82%(T1和T2)，而D3 則分別降低了13.36%和12.05%(T1 和T2)。表明氣溫升高減緩了中度干旱對果實AI 活性的提升作用，增強了重度干旱對果實AI 活性的提升作用。

表5 氣溫升高與干旱對靈武長棗果實AI 活性的影響Table5 Effect of elevated temperature and drought on AI activity in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzo/(mg·g－1FW·h－1)

2.2.2 對NI 活性的影響 由表6可知，3 種土壤含水量水平下，與T1 相比，除成熟期外，T2 中D1 和D2果實NI 活性均升高，而D3 降低，表明氣溫升高在正常土壤供水與中度干旱條件下提升了NI 活性，而在重度干旱條件下降低了NI 活性。與D1 相比，D2 和D3果實NI 活性在著色中期分別增加了7.94% 和56.08%(T1)、14.98%和3.38%(T2)。表明氣溫升高增強了中度干旱對果實NI 活性的提升作用，減緩了重度干旱對果實NI 活性的提升作用。

表6 氣溫升高與干旱對靈武長棗果實NI 活性的影響Table6 Effect of elevated temperature and drought on NI activity in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzo/(mg·g－1FW·h－1)

2.2.3 對SPS 活性的影響 由表7可知，3 種土壤含水量水平下，與T1 相比，T2 中D1 和D2 果實SPS 活性在著色后期和成熟期均升高，而D3 降低，表明氣溫升高在正常土壤供水與中度干旱條件下提升了SPS活性，而在重度干旱條件下降低了SPS 活性。同一大氣溫度環(huán)境中，除幼果期和成熟期外，果實SPS 活性均表現為D2>D1>D3，表明中度干旱提高了果實SPS活性，而重度干旱降低了果實SPS 活性；與D1 相比，D3 果實SPS 活性在成熟期分別降低了11.04%(T1)和45.34%(T2)，表明氣溫升高加劇了重度干旱對果實SPS 活性的抑制作用。

2.2.4 對SS-s 活性的影響 由表8可知，3 種土壤含水量水平下，與T1 相比，T2 中D1 和D2 的果實SS-s活性在幼果期、膨大期和著色后期均升高，而D3 降低，表明氣溫升高在正常土壤供水與中度干旱條件下提高了SS-s 活性，而在重度干旱條件下降低了SS-s 活性。同一大氣溫度環(huán)境中，除著色初期外，果實SS-s活性均表現為D2>D1>D3，表明中度干旱提高了果實SS-s 活性，而重度干旱降低了果實SS-s 活性；與D1 相比，D2 果實SS-s 活性在成熟期分別增加了18.90%和18.56%(T1 和T2)，而D3 分別降低了22.87%和43.21%(T1 和T2)，表明氣溫升高減緩了中度干旱對果實SS-s 活性的提升作用，加劇了重度干旱對果實SS-s 活性的抑制作用。

表7 氣溫升高與干旱對靈武長棗果實SPS 活性的影響Table7 Effect of elevated temperature and drought on SPS activity in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzo/(mg·g－1FW·h－1)

表8 氣溫升高與干旱對靈武長棗果實SS-s 活性的影響Table8 Effect of elevated temperature and drought on SS-s activity in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzo/(mg·g－1FW·h－1)

2.2.5 對SS-c 活性的影響 由表9可知，3 種土壤含水量水平下，總體來看，與T1 相比，T2 中D1 和D2 的果實SS-c 活性降低，而D3 升高，表明在正常土壤供水與中度干旱條件下氣溫升高降低了SS-c 活性，而在重度干旱條件下提升了SS-c 活性。T1 中，除著色后期和成熟期外，各土壤含水量水平下，果實SS-c 活性整體表現為D3>D2>D1，而T2 中表現為D3>D1>D2，表明重度干旱更有利于提升果實SS-c 活性。同一大氣溫度環(huán)境中，與D1 相比，D2 果實SS-c 活性在成熟期分別降低了16.18%(T1)、12.45%(T2)，而D3 分別增加了40.09%(T1)和45.49%(T2)。表明氣溫升高減緩了中度干旱對果實SS-c 活性的提升作用，增強了重度干旱對果實SS-c 活性的提升作用。

2.3 氣溫升高與干旱對靈武長棗果實蔗糖代謝關鍵酶基因表達的影響

2.3.1 對ZjAI基因相對表達量的影響 由圖3可知，相同土壤含水量水平下，T2 中果實成熟期的ZjAI基因相對表達量較T1 均上調；表明氣溫升高促了ZjAI基因的相對表達。在果實成熟期，T1 中，D2 和D3 果實的ZjAI基因相對表達量較D1 分別上調8. 69 和4. 39 倍；而T2 中，D2 果實的ZjAI基因相對表達量較D1 上調0. 57 倍，而D3 下調1. 15倍。表明氣溫升高加劇了重度干旱對ZjAI基因相對表達的抑制作用。

表9 氣溫升高與干旱對靈武長棗果實SS-c 活性的影響Table9 Effect of elevated temperature and drought on SS-c activity in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzo/(mg·g－1FW·h－1)

圖3 氣溫升高與干旱對靈武長棗果實ZjAI基因相對表達量的影響Fig.3 Effect of elevated temperature and drought on ZjAI gene expression in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzao

2.3.2 對ZjNI基因相對表達量的影響 由圖4可知，氣溫升高與干旱交互處理主要在果實發(fā)育前中期促使ZjNI1 和ZjNI2 基因表達上調，在果實發(fā)育后期促使ZjNI3、ZjNI4、ZjNI5 基因表達上調，且ZjNI5 在著色后期和成熟期上調水平較高，而ZjNI2 在幼果期上調水平較高，ZjNI3 和ZjNI4 表達水平整體相對較低。各處理在靈武長棗果實發(fā)育過程中，D3T2 的各基因上調幅度均最大。表明氣溫升高促使ZjNI基因表達上調，氣溫升高伴隨干旱增強了ZjSPS基因的上調表達。

2.3.3 對ZjSPS基因相對表達量的影響 由圖5可知，氣溫升高與干旱交互處理主要在果實發(fā)育后期促使ZjSPS基因表達上調，其中ZjSPS1 和ZjSPS4 上調水平較高，而ZjSPS2 和ZjSPS3 上調水平較低，各處理在靈武長棗果實發(fā)育過程中，D3T2 的各基因上調水平均最大。表明氣溫升高促使ZjSPS基因上調表達，氣溫升高伴隨干旱增強了ZjSPS基因的上調表達。

2.3.4 對ZjSS基因相對表達量的影響 由圖6可知，氣溫升高與干旱交互處理主要在果實發(fā)育后期促使ZjSS基因表達上調，其中ZjSS1 和ZjSS3 上調水平較高，而ZjSS2 上調水平最低。各處理在靈武長棗旱實發(fā)育過程中，D3T2 的各基因上調水平均最大。表明氣溫升高促使ZjSS基因上調表達，氣溫升高伴隨干旱增強了ZjSS基因的上調表達。

3 討論

糖積累是果實品質形成的關鍵，果實品質直接受糖含量和組成的影響。糖是大多數果實成熟時的主要儲存物質，不同品種果實之間以及同一品種果實在不同的發(fā)育時期，糖的積累均存在差異[29-33]。王元基[16]在蘋果果實糖代謝研究中發(fā)現，從幼果期開始適度干旱脅迫可以提高果實蔗糖、果糖含量。本研究發(fā)現，在氣溫升高與重度干旱處理后，靈武長棗果實生長發(fā)育過程中，淀粉含量始終維持在較低水平，且僅在幼果期出現最高含量，為1.04%。各處理在幼果至膨大期，果糖含量均存在一個小的上升階段，而蔗糖含量卻降至最低水平；在果實發(fā)育后期，葡萄糖和蔗糖含量均呈增加趨勢，其中蔗糖含量上升較快，且在成熟期的最終含量約為葡萄糖的2～3 倍。由此可見，靈武長棗果實屬于糖直接積累型。

圖4 氣溫升高與干旱對靈武長棗果實ZjNI 基因相對表達量的影響Fig.4 Effect of elevated temperature and drought on ZjNI gene expression in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzao

果實中糖的積累與其相關代謝酶密切相關，果實獲得同化產物的能力主要由庫強決定，而蔗糖代謝相關酶的活性對庫強和糖卸載能力具有一定影響[22，34-35]，進而影響果實糖分的積累以及糖的組成。王文麗[18]對設施延后栽培葡萄的研究表明，在葡萄著色成熟期輕度水分脅迫可以有效促進果實中各類糖分的積累，重度水分脅迫在各生育期均會降低果實內葡萄糖以及總糖的含量，果實膨大期進行重度水分脅迫，會對后期果實SPS 活性有一定的抑制作用。在本研究中，中度干旱提高了靈武長棗果實AI、SPS、SS-s 活性，降低了果實中SS-c 活性，致使蔗糖的合成方向大于其分解方向，因而中度干旱脅迫有利于果實可溶性糖的積累，減少了果實淀粉含量；重度干旱下，蔗糖代謝酶活性恰好相反，致使蔗糖的分解方向大于其合成方向，催化蔗糖分解，因而重度干旱減少了果實蔗糖含量，增加了果實淀粉含量。由此表明，靈武長棗果實糖積累對干旱的響應可能取決于SPS 活性的高低及SS發(fā)揮活性的主要方向。

圖5 氣溫升高與干旱對靈武長棗果實ZjSPS 基因相對表達量的影響Fig.5 Effect of elevated temperature and drought on ZjSPS gene expression in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzao

果實中糖代謝關鍵酶與其相關基因表達密切相關，果實生長發(fā)育不同階段，酶活性具有較大差異，這可能與酶基因在時空上的表達存在差異有關[36]。本研究發(fā)現氣溫升高與干旱脅迫處理下，ZjNI基因在果實發(fā)育前期上調表達明顯，這與Davies 等[37]關于葡萄漿果中GIN1 和GIN2 基因在果實生長發(fā)育早期表達，在己糖積累開始之前急劇下降的結論一致。ZjAI、ZjSPS和ZjSS基因主要在果實發(fā)育后期上調表達，其中ZjNI1、ZjNI2、ZjSPS1、ZjSPS4、ZjSS1 和ZjSS3 基因的上調表達量較大，且均在氣溫升高伴隨重度干旱處理下上調幅度較大。由此推測，ZjNI1 和ZjNI2 為ZjNI基因的主要表達基因，ZjSPS1 和ZjSPS4 為ZjSPS基因的主要表達基因，ZjSS1 和ZjSS3 為ZjSS基因的主要表達基因，氣溫升高促使蔗糖代謝相關酶主要表達基因表達量上調，且隨著干旱的加劇，上調表達越明顯。由此可知，果實糖代謝對干旱的響應較氣溫升高2.0℃更為敏感，這可能是由于升溫的幅度較小，因而所產生的影響差異不明顯。

4 結論

研究表明，在靈武長棗果實生長發(fā)育階段，氣溫升高2.0℃與干旱處理未改變靈武長棗屬于糖直接積累型和蔗糖積累型的基本模式，中度干旱脅迫有利于靈武長棗果實葡萄糖、果糖和蔗糖的積累，重度干旱脅迫減少了葡萄糖含量，增加了淀粉含量，氣溫升高增加了葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉含量。干旱在靈武長棗果實發(fā)育前期提高了NI 活性，后期降低了NI 活性；中度干旱提高了果實AI、SPS 和SS-s 活性，而重度干旱恰好相反，且提升了果實SS-c 活性，大氣升溫2.0℃時減緩了中度干旱的影響作用，加劇了重度干旱的影響作用；SPS 和SS-s 為促進蔗糖、葡萄糖積累的關鍵酶，NI 為促進果糖積累的關鍵酶。氣溫升高與干旱處理在靈武長棗果實發(fā)育前期主要促進NI(ZjNI1、ZjNI2)和SPS(ZjSPS3)相關基因表達上調，后期主要促進AI、SPS(ZjSPS1 和ZjSPS4)、SS(ZjSS1 和ZjSS3)相關基因表達上調，氣溫升高2.0℃促使蔗糖代謝相關酶基因表達上調，且隨著干旱的加劇上調水平越明顯。

圖6 氣溫升高與干旱對靈武長棗果實ZjSS 基因相對表達量的影響Fig.6 Effect of elevated temperature and drought on ZjSS gene expression in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzao