張 丹 劉 爽 林芙君 邊 帆 蔣更如

2009年，Beck等[1]發(fā)現(xiàn)特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy, IMN)患者腎小球中的M型磷脂酶A2受體(M-type phospholipase A2 receptor，PLA2R)是成人IMN的重要靶抗原, IMN因此被認(rèn)為是一種抗足細(xì)胞抗體介導(dǎo)的自身免疫性腎臟病。此外，抗PLA2R抗體滴度水平與疾病免疫活動度密切相關(guān)，可反映疾病進(jìn)展或緩解情況[2-3]。

雖然IMN并非遺傳性疾病，但近年來隨著對IMN發(fā)病機(jī)制中基因研究的不斷深入，基因多態(tài)性在IMN疾病發(fā)生、發(fā)展中的重要作用逐漸受到關(guān)注。一項(xiàng)通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)的研究發(fā)現(xiàn)，人類白細(xì)胞抗原(HLA)-DQA1和PLA2R1基因與IMN的發(fā)生顯著相關(guān), 且兩種基因的組合型同樣可增加患者對IMN的易感性[4]。此后，國內(nèi)外學(xué)者相繼報(bào)道了不同基因位點(diǎn)與IMN發(fā)生的關(guān)系，但相關(guān)研究結(jié)論仍存在爭議。IMN的發(fā)生、發(fā)展與PLA2R有無相關(guān)性仍待進(jìn)一步明確。

本研究對PLA2R相關(guān)性IMN和非PLA2R相關(guān)性IMN患者的基因型進(jìn)行比較，旨在了解本研究隊(duì)列中PLA2R基因多態(tài)性與PLA2R抗原及其抗體的相關(guān)性，為今后的大樣本研究提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2010年11月—2017年10月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院腎內(nèi)科住院的128例IMN患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：首次入院；腎臟活組織病理學(xué)檢查符合膜性腎病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；排除乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、自身免疫性疾病、惡性腫瘤等引起的繼發(fā)性腎臟疾??；無NSAID、金制劑、青霉胺類等藥物使用史；無有機(jī)溶劑和汞等化學(xué)物質(zhì)接觸史。記錄患者的臨床基礎(chǔ)資料、隨訪資料和病理學(xué)資料。收集患者腎臟活組織病理學(xué)檢查標(biāo)本，制成石蠟切片后于常溫保存。根據(jù)腎臟免疫組織化學(xué)染色結(jié)果中腎小球PLA2R沉積與否分為PLA2R相關(guān)性IMN組和非PLA2R相關(guān)性IMN組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)(XHEC-D-2020-121)。

1.2 基因多態(tài)性檢測

1.2.1 DNA提取 ①用移液管從EDTA抗凝管中取出500 μL患者全血樣本，加入500 μL細(xì)胞裂解液，顛倒混勻5次，2 000×g室溫，離心3 min, 棄上清液；再向沉淀中加入500 μL細(xì)胞裂解液，顛倒混勻5次，2 000×g，室溫離心3 min，棄上清液，將離心管倒置于潔凈無菌的吸水紙上停留2 min, 并確保沉淀在管中(避免沉淀被倒出，推薦使用尖底離心管)。②配置緩沖液GB與蛋白激酶K的混合液；在沉淀中加入混合液200 μL，立即渦旋混勻至溶液無團(tuán)塊；65 ℃放置混懸液10 min, 顛倒混勻數(shù)次。加入200 μL無水乙醇溶液，顛倒混勻至出現(xiàn)絲狀或簇狀沉淀。③將所得溶液和沉淀加入吸附柱CB3[天根生化科技北京(有限)公司]，將吸附柱放入收集管中，13 000×g室溫，離心30 s，倒棄收集管中廢液，將吸附柱CB3放入收集管。向吸附柱CB3中加入500 μL緩沖液GD，13 000×g，室溫離心30 s，倒棄收集管中廢液，將吸附柱CB3放入收集管。向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液，13 000×g，室溫離心30 s，倒棄收集管中廢液，將吸附柱CB3放入收集管；重復(fù)漂洗1次后，13 000×g，室溫離心2 min，倒棄收集管中廢液。④將吸附柱CB3在室溫放置，徹底晾干吸附材料中殘余漂洗液。將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50～200 μL Tris-EDTA(TE)洗脫緩沖液，室溫放置5 min, 13 000×g，室溫離心2 min, 收集上清液至離心管中。

1.2.2 DNA濃度與純度檢測 應(yīng)用紫外分光光度計(jì)(美國艾本德生物公司)進(jìn)行檢測，選擇DNA檢測模式，將樣本稀釋10倍。以雙蒸水沖洗條形槽10次。加入10 μL雙蒸水，確定基線。再以雙蒸水沖洗條形槽10次，加入樣品檢測。

1.2.3 目的基因擴(kuò)增 在文獻(xiàn)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫中檢索DNA序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，堿基序列交由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物序列見表1。

1.2.4 PCR反應(yīng)體系 ①將上述引物以TE緩沖液稀釋至100 μmol/L后等量混合均勻(引物混合液1)。第1輪PCR催化反應(yīng)體系為10 μL ExTaq混合物、1 μL 引物混合液1、50 ng DNA，雙蒸水補(bǔ)充反應(yīng)體系至20 μL。PCR反應(yīng)條件為96 ℃預(yù)變性3 min，96 ℃變性30 s，退火1 min，72 ℃延伸5 min，15個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4 ℃保存。②加入20 μL AMPure磁珠 (美國貝克曼庫爾特生物公司) 混勻靜置5 min， 然后置于磁力架上至磁珠完全分離。棄上清液，加200 μL的80%乙醇溶液靜置30 s，再棄上清液；再次加入200 μL的80%乙醇溶液靜置30 s，再棄上清液。晾干后從磁力架上取下，加入混合液[ExTaq混合物10 μL、引物混合液2(正向引物序列為5’-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3’，反向引物序列為5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA AT 3’；NNN NNN為不同組合的堿基序列，用于區(qū)分不同樣品)2 μL、雙蒸水8 mL]重懸磁珠。第2輪PCR反應(yīng)條件為96 ℃預(yù)變性3 min，96 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸5 min，15個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4 ℃保存。③加入20 μL AMPure磁珠混勻靜置5 min，置于磁力架上至磁珠完全分離。棄上清液，加入200 μL的80%乙醇溶液靜置30 s，再棄上清液；重復(fù)該步驟。晾干后從磁力架上取下，加入20 μL雙蒸水重懸磁珠靜置3 min；再置于磁力架上至磁珠完全分離，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，做好標(biāo)記。

表1 SNP與引物序列

1.2.5 電泳 ①制備緩沖液取5×Tris-硼酸(TBE)緩沖液稀釋成0.5×TBE稀釋緩沖液。②制備膠液，稱取1 g瓊脂糖，倒入錐形瓶中，加入100 mL 0.5×TBE稀釋緩沖液，微波爐加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻后置于室溫冷卻至50 ℃左右。向瓊脂糖凝膠中加入核酸染料，充分混勻。③制備膠版，在制膠槽內(nèi)放入梳子，將前一步驟中的膠液緩慢倒入制膠槽中靜置，形成均勻的膠層。待膠完全凝固后拔出梳子，將內(nèi)槽放入電泳槽中，加入0.5×TBE電泳緩沖液，使其沒過凝膠表面。④加樣，將DNA樣品5 μL與上樣緩沖液1 μL在加樣板上混勻，用移液槍加至凝膠的加樣孔中，中間一個(gè)加樣孔中加入DNA標(biāo)志物。⑤電泳，加樣完畢，開始電泳?？刂齐妷河?0～80 V，電流>40 mA。當(dāng)染料條帶移動至距離凝膠前沿約1 cm時(shí)，停止電泳。取出凝膠，應(yīng)用紫外線透射凝膠成像系統(tǒng)觀察目的條帶的分布情況，有無雜帶出現(xiàn)。拍照、記錄并保存。

1.2.6 測序PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化后在測序儀(HiSeq X Ten，美國因美納生物公司)上進(jìn)行反應(yīng)，分析各樣本位于待測SNP位點(diǎn)處的基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(n)和百分率(%)表示，組間比較采用Pearsonχ2相關(guān)分析或Fisher確切概率法。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

本研究對篩選出的100例PLA2R陽性的IMN患者和28例PLA2R陰性患者進(jìn)行相關(guān)SNP檢測。候選SNP位點(diǎn)包括6個(gè)PLA2R1基因位點(diǎn)和1個(gè)HLA位點(diǎn)。對基因進(jìn)行遺傳平衡檢驗(yàn)，位點(diǎn)基因型、等位基因頻率均達(dá)到遺傳平衡。各位點(diǎn)測序分型后基因型和等位基因頻率見表2。同時(shí)，從HapMap數(shù)據(jù)庫 (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)和Exome Aggregation Consortium外顯子組測序項(xiàng)目(ExAC Browser) (gs:∥gnomad-public/legacy)中分別查詢各位點(diǎn)的次要等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)。

本隊(duì)列IMN患者分別與以上兩個(gè)基因數(shù)據(jù)庫中的健康人群的MAF相比，rs4664308、rs3749117、rs3828323和rs2715928的MAF差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.020、0.009、0.005、0.002、0.001)。PLA2R相關(guān)性IMN組中rs3828323等位基因頻率顯著高于非PLA2R相關(guān)性IMN組(P=0.020)。見表2。

PLA2R相關(guān)性IMN組和非PLA2R相關(guān)性IMN組rs3828323均以CC型為主，前組CC型比例更高，兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.04)。rs4664308、rs2715928和rs3749117在兩組間均分別以純和突變AA型和TT型為主，3組基因在PLA2R相關(guān)性IMN組AA型或TT型人數(shù)均多于非PLA2R相關(guān)性IMN組，但兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。HLA-DQA1基因rs2187668大多為GG型，未發(fā)現(xiàn)AA型。兩組間其他位點(diǎn)基因型的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 PLA2R相關(guān)性IMN組與非PLA2R相關(guān)性IMN組基因型和基因頻率比較

3 討 論

自2009年Beck等證實(shí)PLA2R是IMN特異性靶抗原以來，PLA2R抗原與抗體結(jié)合的相關(guān)基因研究日益受到關(guān)注。2011年，Stanescu等[4]分別對英國、法國和荷蘭的IMN患者進(jìn)行全基因組多態(tài)性的分析顯示，6號染色體的HLA-DQA1 (SNPrs2187668)和2號染色體的PLA2R1(SNPrs4664308)與人群IMN發(fā)病密切相關(guān)，且當(dāng)2種危險(xiǎn)基因型同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，患者患病的危險(xiǎn)度(OR值)可增至8.5，提示2種危險(xiǎn)基因共同參與人群對IMN的易患性。隨后，Lv等[5]對中國人群PLA2R1(SNPrs4664308)和HLA-DQA1(SNPrs2187668)兩種危險(xiǎn)基因型組合(AA/GA+AA)和保護(hù)基因型組合(GG/GG)進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，前者發(fā)生IMN的風(fēng)險(xiǎn)是后者的11.3倍；說明在我國人群中HLA-DQAl和PLA2R1基因多態(tài)性與IMN的發(fā)病機(jī)制亦相關(guān)且兩種基因具有協(xié)同效應(yīng)。研究[5]發(fā)現(xiàn)，在同時(shí)攜帶HLA-DQAl和PLA2R1危險(xiǎn)基因型的患者中，73%的患者血清抗PLA2R抗體呈陽性，75%的患者腎組織中腎小球表達(dá)PLA2R抗原。而含兩種保護(hù)基因型的患者中血清抗PLA2R抗體、腎小球表達(dá)PLA2R抗原均呈陰性。提示抗PLA2R抗體的生成可能與PLA2R1和HLA-DQAl的基因序列改變相關(guān)。目前普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為，一方面，PLA2R基因的改變影響了PLA2R蛋白質(zhì)編碼，繼而改變其表位構(gòu)象；另一方面，HLA基因使其產(chǎn)物HLA Ⅱ類分子發(fā)生結(jié)構(gòu)改變；兩種機(jī)制均可影響PLA2R抗原肽與抗原遞呈細(xì)胞表面HLA分子的結(jié)合，從而影響抗體的產(chǎn)生。

本研究對PLA2R1基因和HLA-DQA1基因的SNP進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比本隊(duì)列IMN患者rs3828323、rs3749117、rs2715928和rs4664308的MAF差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與以往研究結(jié)果一致，即在歐洲白人、西班牙裔、印度裔或亞裔人群中均發(fā)現(xiàn)上述SNP與IMN發(fā)病具有相關(guān)性[4-7]。而rs3828323、rs35771982和rs3749117基因頻率在東亞地區(qū)患病與健康人群中的差異更加明顯，提示基因多態(tài)性在不同種族、地域人群中存在特異性。既往研究結(jié)果也表明，亞洲人群中rs35771982與IMN發(fā)生的關(guān)系更為密切。然而，不同研究的結(jié)果存在一定差異, Kim等[8]針對韓國人群的研究發(fā)現(xiàn)，IMN患者中rs35771982 C等位基因頻率明顯增高；而中國大陸、中國臺灣省和印度的相關(guān)研究[5,7,9]結(jié)果則顯示，rs35771982 G等位基因頻率顯著增高，可能與研究樣本不同種群的差異相關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，PLA2R相關(guān)性IMN組和非相關(guān)性IMN組人群rs3828323均以CC型為主，前者比例更高。部分研究[7-8]同樣發(fā)現(xiàn)，IMN患者rs3828323 CC型較對照人群比例升高。rs3828323 (Gly1106Ser)位于PLA2R1基因24號外顯子，作用于CTLD6和CTLD7間的連接區(qū)域[8]。 由于其錯義突變可替代重要的氨基酸繼而改變PLA2R的抗原性和生物活性，影響抗原與抗體的結(jié)合，因而該基因可能與PLA2R相關(guān)性IMN的發(fā)生更為密切。Lv等[5]比較危險(xiǎn)基因組合型(rs4664308 AA型、rs35771982 GG型和rs3749117 TT型)的IMN患者與保護(hù)基因組合型的IMN患者的研究發(fā)現(xiàn)，前者血清PLA2R抗體和腎組織PLA2R抗原表達(dá)均顯著高于后者。而Kanigicherla等[10]的研究結(jié)果顯示，抗PLA2R抗體滴度水平與PLA2R1 SNP(rs35771982、rs4664308)無顯著相關(guān)性，而與HLA-DQA1、DQB1基因相關(guān)。本研究中，PLA2R相關(guān)性IMN組和非相關(guān)性IMN組rs4664308、rs35771982、rs3749117和rs3749119多以AA型、GG型、TT型和CC型為主，但兩組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，HLA-DQA1基因rs2187668大多為保護(hù)型(GG型)，未發(fā)現(xiàn)AA型。既往研究[4-5]結(jié)果顯示，在歐洲白人中HLA-DQA1基因表達(dá)與IMN發(fā)生更為密切，而中國人群中HLA-DQA1危險(xiǎn)基因型(AA)發(fā)生率則顯著低于白人，且其與PLA2R1基因的協(xié)同作用也較低。近期日本的一項(xiàng)研究[11]顯示，IMN患者多攜帶保護(hù)型基因，未檢測出AA型。以上均提示不同種族人群基因存在差異，可能是白人IMN發(fā)病率高的原因之一。

由于本研究為單中心實(shí)驗(yàn)，且樣本量較小，尤其是非PLA2R相關(guān)性IMN組人數(shù)較少，因此研究結(jié)果可能產(chǎn)生偏倚。由于種族因素與基因表達(dá)密切相關(guān)，目前不同研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)的致病位點(diǎn)，以及關(guān)聯(lián)程度并不相同，并且PLA2R抗原肽構(gòu)象改變和表位暴露也可能與環(huán)境因素相關(guān)，或是環(huán)境與基因共同作用的結(jié)果。因此，現(xiàn)有的研究結(jié)果都需要通過更大樣本量、更多不同種族人群的比對加以驗(yàn)證。