高音來　陳芯儀　何灝龍　鄭慧娥　朱鈺　譚濤　陳楚淘　田浩梅

〔摘要〕 目的 探討調心通督法對血管性癡呆（vascular dementia，VD）大鼠學習記憶功能及海馬堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）表達的影響。方法 SD大鼠行Morris水迷宮實驗篩選出特異性大鼠后隨機分出6只假手術組，其余大鼠采用雙側頸總動脈永久性結扎法（2-VO）復制VD大鼠模型，造模后再按隨機數(shù)字表法分為模型組、西藥對照組、調心通督法針刺組，每組6只。于造模成功后及治療后分別采用Morris水迷宮實驗觀察大鼠學習記憶能力，Western Blot法檢測雙側海馬bFGF蛋白表達。結果 造模后，與假手術組比較，各組大鼠平均逃避潛伏期時間明顯增加，且找到平臺次數(shù)明顯減少（P<0.01）。治療后，與模型組相比，西藥對照組、調心通督法針刺組平均逃避潛伏期明顯縮短（P<0.01），穿越原平臺次數(shù)增加（P<0.05）;與西藥對照組比較，調心通督法針刺組差異不具有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與假手術組比較，各組大鼠海馬區(qū)bFGF表達均升高（P<0.01）;與模型組比較，西藥對照組及調心通督法針刺組海馬bFGF表達均明顯增高（P<0.05）。結論 調心通督法能明顯改善VD大鼠學習記憶能力、上調海馬bFGF表達，可能是其重要作用機制之一。

〔關鍵詞〕 血管性癡呆;調心通督法;堿性成纖維細胞生長因子;學習記憶

〔中圖分類號〕R246.6? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.01.019

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of Tiaoxin Tongdu method on learning and memory function and basic fibroblast growth factor （bFGF） expression in hippocampus of vascular dementia （VD） rats. Methods SD rats were selected by Morris water maze test and then randomly divided into 6 sham operation groups. VD rat model was established by permanent ligation of bilateral common carotid artery （2-VO）. The other rats were divided into a model group， a western medicine control group and Tiaoxin Tongdu method acupuncture group according to the random number table method， with 6 rats in each group. Morris water maze test was used to observe the learning and memory ability of rats after successful modeling and after treatment. Western Blot method was used to detect the expression of bFGF protein in bilateral hippocampus. Results Compared with sham operation groups， the average escape latency time of rats in each group increased significantly， and the number of platforms found decreased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， the average escape latency was significantly shortened （P<0.01） and the number of times crossing the original platform was increased （P<0.05） in the western medicine control group and the Tiaoxin Tongdu method acupuncture group. Compared with the western medicine control group， the difference of the Tiaoxin Tongdu method acupuncture group was not statistically significant （P>0.05）. Compared with the sham operation groups， the expression of bFGF in hippocampus of each group was increased （P<0.01）. Compared with the model group， the expression of bFGF in hippocampus of the western medicine control group and the Tiaoxin Tongdu method acupuncture group increased significantly （P<0.05）. Conclusion Tiaoxin Tongdu method can significantly improve the learning and memory ability of VD rats， and up-regulation of bFGF expression in hippocampus may be one of its important mechanisms.

〔Keywords〕 vascular dementia; Tiaoxin Tongdu method; basic fibroblast growth factor; learning and memory

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是主要由長期慢性低灌注的顱內血管疾病所致的記憶障礙綜合征。隨老齡化社會的到來，血管性癡呆的發(fā)病率逐年遞增[1]。該病嚴重影響著患者自身、家庭乃至整個社會，預防及醫(yī)治VD已被世界衛(wèi)生組織列為21世紀重點科研項目之一[2-3]。前期臨床研究[4]表明由名老中醫(yī)嚴潔教授提出以心包經和督脈為主的“調心通督”法能提高VD患者簡易智力狀態(tài)檢查（mini-

mental state examination，MMSE）評分，改善其自理能力，提示慢性低灌注腦組織的保護、修復過程與調心通督法相關，但其作用機制尚待探討。

堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是一種能作用于體內及體外的多效性血管生長因子[5-6]，作為主要的血管生長因子之一，對促進細胞有絲分裂、血管生成、神經修復、創(chuàng)面愈合及內皮細胞新生具有不可替代的調節(jié)作用[7-9]。陳倩倩[10]、唐強[11]、王亞軍等[12]均觀察到針刺可通過上調bFGF的表達來促進腦缺血區(qū)的血管新生。因此，本實驗研究將從重要的血管新生因子bFGF著手，觀察調心通督法對VD大鼠學習記憶能力的改變及bFGF蛋白的表達情況，探討調心通督法醫(yī)治VD的作用機制，為今后針灸治療VD提供充分的理論和實驗支持。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物及分組

45只SPF級雄性SD大鼠，體質量控制在200～250 g，購自湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，許可證號：SCXK（湘）2016-0002，合格證號：43004700057075。將大鼠置于SPF級動物實驗房飼養(yǎng)，保持室溫20～22 ℃，濕度50%～60%，飲食、飲水自由，喂養(yǎng)及治療期間隔天清洗籠盒及更換墊料，水迷宮實驗期間每天清洗并更換。適應性喂養(yǎng)1周，行Morris水迷宮實驗后篩選出特異性大鼠，保留43只，按隨機數(shù)表法選出6只為假手術組，其余大鼠造模后行水迷宮實驗檢測，篩選出造模成功的VD大鼠18只，分為模型組、西藥對照組、調心通督法針刺組，6只/組。實驗過程中大鼠死亡時，剔除并補錄，統(tǒng)一為發(fā)現(xiàn)情況的第2日上午采取簽盒抽簽的方式進行補錄。本實驗大鼠死亡率約為50%。實驗動物處理的倫理學依據參照中華人民共和國科學技術部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2? 主要試劑與儀器

10%水合三氯乙醛（長沙-維爾生物科技有限公司），絡合碘（長沙-歐潤消毒科技有限公司），注射用青霉素鈉（江西-科達動物藥業(yè)有限公司），ABclonal抗體（北京-鼎國生物技術有限公司），安迪牌0.30 mm×25 mm無菌針灸針（貴州-安迪藥械有限公司），Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（法國View-point公司），電子天平（杭州-恒儀儀表科技有限公司）。

1.3? 動物模型復制與評定標準

所有大鼠術前12 h禁食，不禁水。除假手術組外，其余各組采用雙血管阻斷法[13]（2-VO）模擬VD模型，用10%的水合三氯乙醛（0.3 mL/100 g）將大鼠麻醉后固定于鼠板上，待備皮、消毒后沿頸部中央前方逐層分離皮膚及皮下組織，依次暴露雙側頸總動脈，以4～0號線分別于近心端與遠心端結扎并從中間剪斷，傷口內撒入適量青霉素，以3～0號線縫合皮膚。注意手法柔和、無菌操作。假手術組操作方法一致，但不結扎剪斷雙側頸總動脈。

模型成功的判斷標準[14]：造模2周后行Morris水迷宮實驗，以假手術組作參照，計算各造模組大鼠逃避潛伏期分別與假手術組逃避潛伏期平均值之差占該鼠平均逃避潛伏期的比值，若該值大于20%，則為血管性癡呆模型。

1.4? 各組干預方法

假手術組和模型組：只捆綁，不給藥，不針刺。調心通督針刺組：根據《實驗針灸學》及華興邦《實驗動物圖譜》，選取“命門”“大椎”直刺5 mm，“風府”向下斜刺5 mm，“百會”“神庭”平刺10 mm，“水溝”向鼻中隔方向斜刺2 mm，“內關”直刺5 mm，“大陵”“勞宮”直刺2 mm;不給藥，捆綁后針刺，采取平補平瀉手法，留針30 min。西藥對照組：予尼莫地平（0.0625 g/kg）與蒸餾水混合至0.01 g/mL灌胃，給藥后捆綁，不針刺。各組干預1次/d，持續(xù)2周。

1.5? Morris水迷宮行為學檢測

Morris水迷宮[15]外形為一圓形水池，分為4個象限，任一象限中央可放置直徑10 cm低于水面2 cm的無色透明平臺。前5天為定位航行試驗：每天固定時段訓練4次，設定時限為120 s，將大鼠四肢完全站上平臺耗時，記為“逃避潛伏期”。前2天作為大鼠適應期，不計入成績，最終以第3天到第5天平均耗時作為其有效成績。第6天為空間探索試驗：撤除小平臺，任選同一象限將大鼠放入水中，測出120 s內大鼠經過平臺區(qū)域次數(shù)。

1.6? 腦組織取材及指標檢測

各組大鼠先以10%的水合三氯乙醛（0.3 mL/100 g）進行腹腔注射麻醉后迅速斷頭取腦，再將雙側海馬分離放入標記好編號的EP管中，置于干冰箱中低溫保存，隨后移至-80 ℃冰柜凍存，采取Western Blot檢測法進行樣品制備。

Western Blot法檢測海馬中bFGF蛋白表達：按比例將海馬組織加入裂解液，提取海馬總蛋白。進行蛋白定量取上清液用BCA蛋白定量試劑盒，計算出蛋白濃度。采用10%分離膠和5%濃縮膠行SDS-PAGE電泳，NC膜轉移，轉膜后在室溫搖晃閉存1 h，之后加入一抗（兔多抗），4 ℃孵育一宿，TBST洗膜，5 min×4次;將膜轉入二抗（兔多抗），室溫孵育1 h，TBST洗膜，5 min×5次;用化學發(fā)光法（ECL）顯影，掃描、存檔，Image-J軟件測出各條帶灰度值進行分析。

1.7? 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，對所有數(shù)據均使用“x±s”表示。水迷宮實驗數(shù)據采用重復測量方差分析，多組間比較可用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05作為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 定位航行實驗-逃避潛伏期時長

組間比較：造模前，各組大鼠平均逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。造模后，與假手術組比較，各組大鼠平均逃避潛伏期時間明顯增加（P<0.01）。治療后，與模型組相比，西藥對照組、調心通督法針刺組平均逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與西藥對照組比較，調心通督法針刺組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。組內比較：假手術組造模前、造模后及治療后兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與造模前比較，造模后與治療后模型組平均逃避潛伏期時間明顯增加（P<0.01）;與造模后比較，治療后模型組平均逃避潛伏期時間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與造模前比較，造模后西藥對照組、調心通督法針刺組平均逃避潛伏期時間明顯增加（P<0.01），治療后西藥對照組、調心通督法針刺組平均逃避潛伏期時間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與造模后比較，西藥對照組、調心通督法針刺組平均逃避潛伏期縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖1、表1。2.2? 空間探索實驗-穿越平臺次數(shù)

組間比較：造模前，各組大鼠穿越平臺次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。造模后，與假手術組比較，各組大鼠穿越原平臺次數(shù)明顯減少（P<0.01）。治療后，與模型組相比，西藥對照組、調心通督法針刺組穿越原平臺次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與西藥對照組比較，調心通督法針刺組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。組內比較：假手術組造模前、造模后及治療后兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與造模前比較，造模后與治療后模型組穿越原平臺次數(shù)明顯減少（P<0.01）;與造模后比較，治療后模型組穿越原平臺次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與造模前比較，造模后西藥對照組、調心通督法針刺組穿越原平臺次數(shù)明顯減少（P<0.05），治療后西藥對照組、調心通督法針刺組穿越原平臺次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與造模后比較，西藥對照組、調心通督法針刺組穿越原平臺次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3? 各組大鼠海馬區(qū)bFGF蛋白的表達情況

與假手術組比較，造模組大鼠海馬區(qū)bFGF蛋白表達明顯增加（P<0.01）;與模型組比較，西藥對照組、調心通督法針刺組海馬bFGF蛋白表達均明顯增高（P<0.05或P<0.01）;西藥對照組與調心通督針刺組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖2、表3。

3 討論

中醫(yī)古籍中血管性癡呆多屬于“癡呆”“呆病”的范疇，其病位在腦，頭為“清陽之腑”，臟腑之精血清氣皆上注入腦，而督脈的循行與其密切相關。心為“君主之官”，因心包絡作為脂膜護衛(wèi)心于外，說明心包經協(xié)助心經完成心主血脈、主神明之功。因此心包代心受邪，故治療以心包經與督脈為主。“調心通督”法為名老中醫(yī)嚴潔教授多年來的臨床和科研實踐總結，以督脈上“百會”“神庭”“大椎”“風府”“水溝”“命門”，配以心包經上“內關”“大陵”“勞宮”等穴，達到醒腦開竅、清利頭目、平衡陰陽等作用，其臨床療效顯著。

本研究實驗發(fā)現(xiàn)，造模后與假手術組比較，各組大鼠平均逃避潛伏期時間明顯增加，且找到平臺次數(shù)明顯減少，說明造模組耗時長，學習記憶能力下降，提示VD大鼠模型制備成功。治療后與模型組相比，藥物及針刺組平均逃避潛伏期明顯縮短，穿越原平臺次數(shù)增加，與西藥對照組比較，調心通督法針刺組差異不顯著，提示西藥、針刺均能明顯改善VD大鼠的學習記憶能力，且治療效果旗鼓相當。組內間與造模后比較，治療后調心通督法針刺組平均逃避潛伏期縮短，穿越原平臺次數(shù)增加，說明調心通督法治療VD大鼠療效肯定。bFGF是最為有效的血管生長因子之一，可增強內皮細胞黏附遷移、分裂增殖、促進血管新生。大量實驗研究表明[16-17]bFGF是血管發(fā)生的啟動因子，能修復毛細血管，使血管得以再生或重塑，并能刺激VEGF的增殖，上調血管內皮細胞生長因子發(fā)揮作用[18-20]，共同促進血管生成。與假手術組比較，造模組大鼠海馬區(qū)bFGF蛋白表達明顯增加;與模型組比較，西藥對照組、調心通督法針刺組海馬bFGF蛋白表達均明顯增高，有顯著性差異，但兩組差異無統(tǒng)計學意義。本實驗說明通調心通督法可促進VD大鼠海馬區(qū)bFGF蛋白的表達，從而實現(xiàn)血管的修復與再生，提高其學習記憶能力。

綜上所述，調心通督法針刺VD大鼠可以改善其學習記憶能力可能與增加海馬區(qū)bFGF蛋白表達有關。它作為具有中醫(yī)特色的針刺療法，不僅得到驗證其臨床療效好，且相比目前其它治療其不良反應小、安全性高，具備多方面臨床治療優(yōu)勢。本實驗從動物實驗研究調心通督法治療VD的作用機制，以便更好的為臨床針刺治療VD提供客觀的實驗依據，值得加快推廣應用。

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（本文編輯? 匡靜之）