王艷　王珂

[摘 要] 目的：觀察銀杏達莫注射液對血管性癡呆大鼠的學習記憶及海馬區(qū)神經(jīng)元干預作用。 方法：大鼠分為三組：假手術組、安慰劑組、銀杏達莫組。采用改良雙側頸總動脈阻斷方法制備血管性癡呆大鼠模型。利用Morris水迷宮評價大鼠的學習記憶能力，顯微鏡觀察海馬區(qū)CA1區(qū)神經(jīng)元的組織形態(tài)結構。結果：與假手術相比，安慰劑組大鼠平均逃避潛伏期明顯延長（P<0.05），而銀杏達莫組大鼠平均潛伏期較安慰劑組明顯減少（P<0.05）。形態(tài)學觀察顯示安慰劑組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞排列紊亂、數(shù)量較少，甚至神經(jīng)細胞壞死、凋亡。銀杏達莫組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目、形態(tài)較安慰劑組均有明顯改善。結論：銀杏達莫注射液對VD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞具有保護作用，從而改善血管性癡呆大鼠的學習記憶能力。

[關鍵詞] 血管性癡呆；大鼠；銀杏達莫；海馬區(qū)；學習記憶

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：B 文章編號：2095-5200（2015）06-030-03

DOI：10.11876/mimt201506012

血管性癡呆（Vascular dementia，VD）是指各種腦血管疾病引起腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能損害綜合癥，以高級神經(jīng)認知功能障礙，如學習記憶、認知功能受損等為主要表現(xiàn)，可伴有一系列異常神經(jīng)心理癥狀和精神行為，是繼阿爾茨海默病之后第二大癡呆疾。VD可以防治，早期治療，具有可逆性[1-2]。目前，已有文獻報道：銀杏達莫注射液具有改善腦部微循環(huán)、營養(yǎng)神經(jīng)、清除自由基、抑制神經(jīng)細胞凋亡，改善由于腦缺血引起癥狀和記憶功能等功效[3]。銀杏達莫注射液對血管性癡呆具有較好臨床療效，但機制研究證據(jù)較少。本研究在動物模型上觀察銀杏達莫注射液對血管性癡呆治療效果及可能的治療機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗對象為健康雄性SD大鼠，數(shù)量30只，體重在250～300g，SPF級。OPJ-1B型切片機由天津天利航空機電有限公司生產(chǎn)；80i正置顯微鏡由日本Nikon生產(chǎn)；Morris水迷宮由中國醫(yī)學科學院藥物研究所研制生產(chǎn)。銀杏達莫注射液（國藥準字H52020032），由貴州益佰制藥股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法與分組

SD大鼠經(jīng)1周適應性飼養(yǎng)，采用Morris水迷宮篩選實驗動物，淘汰不能勝任水迷宮大鼠。將符合要求大鼠隨機選出20只，改良雙側頸總動脈阻斷方法制備血管性癡呆動物模型，余下10只為假手術組，給予相應手術處理但不阻斷雙側頸總動脈。手術死亡大鼠剔除實驗，并補充相應數(shù)目大鼠。術后第2天將造模大鼠，隨機分為2組：銀杏達莫組給予銀杏達莫注射液（劑量為2.7mg/kg）靜脈注射 [4]，安慰劑組、假手術組給予等體積生理鹽水靜脈注射，療程為2周[5]。治療結束后，利用Morris水迷宮裝置對各組大鼠進行定位航行試驗，記錄各組大鼠逃避潛伏期。

1.3 制備血管性癡呆動物模型

改良雙側頸總動脈（CAA）阻斷法制備血管性癡呆模型[6]。術前12h禁食，10%水合氯醛（350mg/kg體重）腹腔麻醉，取仰臥位，固定于手術臺上；行相關手術前準備，頸部正中切口，依次切開皮膚、皮下組織，分離肌肉、血管、神經(jīng)，充分暴露一側頸總動脈，給予結扎、剪斷該血管；依次縫合肌肉、皮下組織及皮膚。間隔7天后，同樣方法再次處理對側頸總動脈。

1.4 大鼠學習記憶能力測定

利用Morris水迷宮對各組大鼠進行學習記憶評估[7]。定位航行實驗（水下任務實驗），記錄大鼠從入水至爬上平臺時間，即逃避潛伏期。逃避潛伏期長短可以客觀反映大鼠空間學習記憶能力。連續(xù)進行5天定向航行試驗，每日4次（上午、下午各2次）。大鼠第5天4次平均逃避潛伏期為該大鼠最終測試時間。

1.5 大鼠腦組織HE切片

大鼠經(jīng)10%水合氯醛（350mg/Kg）腹腔麻醉，經(jīng)心臟灌注生理鹽水50mL，再用含2%多聚甲醛、1%戊二醛混合液100～250mL灌注固定，時間不超過6min，1h后取腦，每個標本放入4%多聚甲醛PBS溶液中固定4～6h，沿矢狀位切成小塊，在30%蔗糖溶液中脫水12h后包埋于石蠟中。采用蘇木素-伊紅（HE染色）腦組織切片，光學顯微鏡下（×400）觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)及數(shù)目。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行相關數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用x±s表示。

2 結果

2.1 三組大鼠癥狀表現(xiàn)

雙側頸總動脈假阻斷術后當日大鼠表現(xiàn)為運動減少、進食及飲水較少，之后逐漸恢復。術后2周時假手術組大鼠表現(xiàn)為進食水、活動及精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度恢復至術前水平。安慰劑組表現(xiàn)為大鼠進食、飲水逐漸恢復，目光遲鈍，活動量較術前明顯減少，毛發(fā)臟亂，缺少光澤，對外界刺激反應淡漠。銀杏迖莫組大鼠表現(xiàn)為活動量較手術前稍減少、毛發(fā)粗糙、欠光澤，對外界反應遲鈍。

2.2 大鼠定位航行試驗

假手術組平均逃避潛伏期為（12.91±4.86）s；安慰劑組平均逃避潛伏期為（36.92±7.64）s。與假手術組相比，血管癡呆組平均逃避潛伏期明顯延長（P<0.05），說明該組SD大鼠出現(xiàn)了學習記憶功能受損。而銀杏達莫組大鼠平均逃避潛伏期為（28.23±7.21）s。與安慰劑組相比，銀杏達莫組平均逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），但與假手術組相比，銀杏達莫組平均逃避潛伏期仍延長（P<0.05）。

2.3 銀杏達莫對血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元

影響

假手術組SD大鼠腦海馬CA1區(qū)HE染色顯示：海馬區(qū)CA1區(qū)神經(jīng)元細胞呈圓形或橢圓型，細胞核染成淡藍色，與細胞槳界限清晰，細胞排列緊密，外形規(guī)則，呈3～5層排列，未見異常結構（見圖A）。安慰劑組大鼠海馬CA1區(qū)HE染色可見：海馬錐體細胞排列紊亂、細胞間隙增大，細胞數(shù)目明顯減少，細胞核與胞漿分界不清，出現(xiàn)核固縮、變形，可見軟化灶、細胞壞死明顯（見圖B）。銀杏達莫組海馬區(qū)組織切片可見：細胞體積變大，細胞水腫，細胞局部壞死；細胞排列較整齊，可見多層排列輪廓，海馬CA1神經(jīng)元數(shù)目、形態(tài)較安慰劑組均有明顯改善（見圖C）。

3 討論

銀杏達莫注射液是以銀杏葉提取物為基礎復合制劑，主要有效成分為銀杏內(nèi)酯類、銀杏黃酮苷、百果內(nèi)酯、雙嘧達莫等；具有改善微循環(huán)、抗血小板聚集、清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等多重藥理作用，可以防止細胞內(nèi)鈣離子超載、拮抗谷氨酸等興奮性氨基酸引起神經(jīng)毒性[8-9]。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，銀杏達莫注射液對血管性癡呆治療預防療效確切，但其治療血管性癡呆機制尚未闡明[5，10]。本研究通過觀察銀杏達莫注射液對VD大鼠學習記憶功能及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞影響，探討VD發(fā)病機制和銀杏達莫治療VD作用機制。

本實驗采用Morris水迷宮評價大鼠學習和記憶能力，其所測量指標為大鼠逃避潛伏期；逃避潛伏時間越長，學習記憶能力越差。本研究顯示：銀杏達莫組大鼠平均逃避潛伏期較安慰劑組明顯縮短（P<0.05）；但與假手術組相比，銀杏迖莫組平均逃避潛伏期仍延長（P<0.05）。因此，該研究表明銀杏達莫注射液可以有效改善血管性癡呆大鼠學習記憶能力，但不能使其達到正常大鼠學習記憶水平。

海馬作為大腦邊緣系統(tǒng)主要組成部分，參與學習、記憶、情緒調(diào)節(jié)等功能活動，被認為學習記憶關鍵腦區(qū)[11]。臨床上，學習記憶受損常是血管性癡呆患者首發(fā)和較為突出癥狀。研究表明，血管性癡呆患者學習記憶受損與海馬區(qū)神經(jīng)元變性、壞死、凋亡關系密切[12-15]。本研究也顯示：銀杏達莫組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞較少表現(xiàn)為變性、壞死及凋亡特征，其神經(jīng)元細胞數(shù)目明顯多于安慰劑組。海馬與動物學習記憶關系最為密切。由此可以推測，銀杏達莫改善血管性癡呆大鼠學習記憶能力，其可能通過增強海馬區(qū)神經(jīng)元對缺氧耐受、抑制海馬區(qū)神經(jīng)元壞死及凋亡、修復損傷神經(jīng)等多靶點調(diào)控機制，從而保護海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量及功能。

綜上所述，本研究顯示：銀杏達莫注射液通過對海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞保護作用，顯著改善VD大鼠學習記憶能力，其可能機制為減輕腦缺血再灌注損傷，抑制海馬神經(jīng)元壞死、凋亡，修復神經(jīng)損傷。但具體作用機制還有待于進一步研究。

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