張露云，車(chē)環(huán)宇，于俊林，張立秋，夏廣清*，臧 皓*

（通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院·吉林通化·134002）

中藥鑒定是中醫(yī)藥研究的重要基礎(chǔ)課題，其宗旨是解決中藥材“真?zhèn)蝺?yōu)劣”的關(guān)鍵問(wèn)題，傳統(tǒng)的性狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定等中藥鑒定方法存在主觀性強(qiáng)、穩(wěn)定性和重復(fù)性差等方面的弱點(diǎn)。DNA條形碼是運(yùn)用基因組中公認(rèn)的一段DNA片段進(jìn)行物種鑒定的分子診斷技術(shù)[1]。DNA分子標(biāo)記是以生物間核苷酸差異為根本的標(biāo)記技術(shù)，是在DNA水平上對(duì)遺傳物質(zhì)差異的反應(yīng)，能夠更精準(zhǔn)的揭示種間、種類的差異，且不受環(huán)境、發(fā)育階段的影響，多態(tài)性強(qiáng)、數(shù)量豐富、分布廣泛均勻，近年來(lái)此技術(shù)已得到普遍關(guān)注，并成為生物鑒定與分類研究的熱門(mén)[2-3]。DNA條形碼用以中藥分子鑒定的新技術(shù)、可以敏捷、精確地鑒定物種，待測(cè)的樣品只需要經(jīng)過(guò)DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)、基因測(cè)序和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，便可確定物種，能便利地進(jìn)行種間區(qū)分[4-5]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)東北地區(qū)6種當(dāng)歸屬物種采用4種DNA條形碼序列（IST2、葉 matK、rbcL和trnH-psbA)進(jìn)行系統(tǒng)地評(píng)估，對(duì)比不同序列間PCR擴(kuò)增、測(cè)序成功率及不同片段的物種鑒別率等，目的是篩選得到適用于鑒定多種當(dāng)歸屬物種的DNA條形碼，為東北產(chǎn)當(dāng)歸屬植物鑒別提供了重要參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

收集長(zhǎng)白山區(qū)分布的當(dāng)歸屬全部6個(gè)物種，每個(gè)物種采集3個(gè)樣本，樣品表及序列登錄號(hào)見(jiàn)表1。此外，從GenBank上下載尖葉藁本Ligusticumacum inatum，濱海前胡 Peucedanum japonicum，泰山前胡Peucedanum.wawrae 3個(gè)物種8個(gè)樣品的ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH序列作為外類群，通過(guò)解析Gen-Bank的.gb 文件確保同一組 ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH序列均來(lái)自于相同的Voucher number，即同1個(gè)樣品，從而確保序列對(duì)齊。DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co)，2×PCR mix(Aidlab Biotechnologies Co)。

表1 樣本及序列登錄號(hào)

表2 從GenBank下載的外類群序列

1.2 儀器

球磨儀(德國(guó)Retsch公司MM400型)；高速離心機(jī)(德國(guó)sigma公司1-14型)；超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司NanoDropOne型)；電子天平(德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司SQP型)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增儀（T100型)；電泳儀(北京六一生物科技有限公司DYY-6C型)；測(cè)序儀(美國(guó)Applied Biosystems公司ABI3730XL型)；凝膠成像儀 (美國(guó) Bio-Rad公司GhemiDoc TM XRS+型)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DNA提取及濃度測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[6-8]中報(bào)道的方法取硅膠干燥的葉片樣本 10～20 mg，球磨儀研磨 2 min(每秒 30 次)，隨后應(yīng)用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA，并測(cè)定OD值及A260/A280比值。另取一不含樣品的空管，依照上法操作以排除實(shí)驗(yàn)室中可能得環(huán)境污染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.2 PCR擴(kuò)增、克隆及測(cè)序

根據(jù)文獻(xiàn)[9-11]中報(bào)道的方法擴(kuò)增了ITS2、matK、rbcL和psbA-trnH序列，引物和擴(kuò)增步驟如表3所示。 取 PCR 反應(yīng)體系 25 μL，2×PCR mix 12.5 μL，2.5 mM正向和反向引物各1μL，模板DNA 2 μL，滴加無(wú)菌雙蒸水至25 μL，將無(wú)模板DNA的PCR反應(yīng)設(shè)為陰性對(duì)照。使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。使用測(cè)序儀對(duì)純化擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。

表3 引物序列和擴(kuò)增條件

2.3 數(shù)據(jù)分析

使用CondonCode Aligner V 9.0.1(CodonCode Co.,USA)軟件進(jìn)行序列的比對(duì)、拼接并去除引物區(qū)域。使用隱馬爾可夫模型 (Hidden Markov Model,HMM)除去ITS2序列的5.8S rRNA和28S rRNA基因區(qū)，基于同源序列比對(duì)去除psbA-trnH序列的psbA基因序列和trnH序列，rbcL和matK去除引物后直接進(jìn)行分析。MEGAX軟件用于多序列比對(duì)和構(gòu)建NJ(Neighbor-Joining)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，應(yīng)用Bootstrap檢驗(yàn)各分支的支持率(重復(fù)1000次)。利用PAUP 4.0軟件進(jìn)行遺傳距離計(jì)算，采用自己編寫(xiě)的Python程序進(jìn)行DNA條形碼GAP分析?；贐LAST和Tree-Building方法進(jìn)行物種鑒定。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

DNA提取結(jié)果表明，長(zhǎng)白山當(dāng)歸屬的硅膠干燥葉片非常容易獲取高質(zhì)量的DNA，取樣10～20 mg、水浴40 min所獲得DNA的平均OD值為190.0 ng/μL，A260/A280的值均處于1.8～2.0之間，詳見(jiàn)表4。所有樣品均可成功地進(jìn)行ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL序列的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳圖中psbA-trnH、ITS2、rbcL和matK序列的條帶大小約為300、500、750和900 bp。所有PCR產(chǎn)物均成功測(cè)序，其中ITS2序列可以得到高質(zhì)量的雙向測(cè)序峰圖，psbA-trnH序列存在兩處Ploy結(jié)構(gòu)，但是其不影響測(cè)序峰圖的質(zhì)量，由于rbcL和matK序列片段較大，測(cè)序峰圖的兩端質(zhì)量較差，需要進(jìn)行人工矯正。

表4 樣品DNA的質(zhì)量

3.2 種間種內(nèi)遺傳距離和DNA條形碼GAP分析

從種間變異來(lái)看，ITS2序列的種間距離最大，為0.0447，rbcL序列的種間距離最小，為0.0005，兩者相差近90倍；ITS2序列的種間最小距離最大，為0.0346，但其種內(nèi)最大距離僅為0.0015，兩者相差約23倍，ITS2的種間最小距離顯著大于種內(nèi)最大距離；對(duì)于種內(nèi)距離，只有psbA-trnH序列的種內(nèi)距離較大，這主要是因?yàn)殚L(zhǎng)鞘當(dāng)歸的樣品間存在6 bp的Inversion區(qū)域，樣品HSPS3104和HSPS3106的序列為“TTCTAT”，而樣品 HSPS3105 為“ATAGAA”，造成對(duì)種內(nèi)距離的高估。種內(nèi)與種間距離的分析結(jié)果詳見(jiàn)表5。從DNA條形碼GAP分析來(lái)看，所有物種的ITS2和matK序列均存在DNA條形碼GAP，ITS2比matK序列的DNA條形碼GAP更明顯，說(shuō)明物種的界限較清晰；3個(gè)物種的psbA-trnH序列存在DNA條形碼GAP；僅有1個(gè)物種的rbcL序列存在DNA條形碼GAP。

表5 種間種內(nèi)變異分析

3.3 基于BLAST和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的物種鑒定分析

基于BLAST方法，采用在數(shù)據(jù)庫(kù)中去除自身序列的策略，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。ITS2和matK序列在樣品水平和物種水平的物種鑒定效率均為100%，表明所有物種和樣品均可以被鑒定。psbA-trnH序列在樣品水平和物種水平的物種鑒定效率分別為61.11%和50%，物種水平和樣品水平的物種鑒定效率不一致的原因?yàn)殚L(zhǎng)鞘當(dāng)歸的樣品HSPS3105的Inversion方向，與樣品HSPS3104和HSPS3106的Inversion方向不同，導(dǎo)致HSPS3105樣品鑒定失敗。rbcL序列的物種鑒定能力僅為16.67%，是最低的。圖2-5所示的分析結(jié)果表明，在以ITS2和matK序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，6個(gè)物種均可聚為獨(dú)立的分枝，這可以清晰的相互區(qū)分，ITS2序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的枝長(zhǎng)差異更明顯；基于psbA-trnH序列，長(zhǎng)鞘當(dāng)歸分為兩個(gè)枝，朝鮮當(dāng)歸與黑水當(dāng)歸聚為一個(gè)枝，無(wú)法區(qū)分；對(duì)于rbcL序列，僅有拐芹聚為一個(gè)獨(dú)立的枝，可以與其他物種相互區(qū)分，其余5個(gè)物種相互交叉，無(wú)法區(qū)分。

圖1 基于BLAST方法的物種鑒定效率分析

圖2 基于ITS2序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值為2000.

圖3 基于psbA-trnH序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值為2000.

圖4 基于rbcL序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值為2000.

圖5 基于matK序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值為2000.

4 討論

ITS2、rbcL、matK、psbA-trnH 序列為藥用植物鑒定中的常用序列，本實(shí)驗(yàn)選取這4個(gè)序列進(jìn)行DNA條形碼研究，所有樣品均能成功進(jìn)行序列的擴(kuò)增?？傮w來(lái)看，matK序列引物的通用性較差，rbcL序列的物種鑒定效率較低，psbA-trnH序列的重復(fù)結(jié)構(gòu)較多，測(cè)序成功率較低，而ITS2序列的鑒定成功率高達(dá)100%。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，6種植物各自聚為一支，可以很好地區(qū)分開(kāi)。以上結(jié)果表明，ITS2序列能很好地對(duì)當(dāng)歸屬植物進(jìn)行鑒別。

本研究首次應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)東北當(dāng)歸屬植物進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，研究結(jié)果證明ITS2序列能夠快速、準(zhǔn)確、有效鑒定上述植物，方法操作簡(jiǎn)便，易于掌握?；贗TS2序列的DNA條形碼技術(shù)在當(dāng)歸屬植物鑒定中的應(yīng)用有效地保障了種質(zhì)資源鑒別的真實(shí)性，具有較大潛力。

5 結(jié)論

本研究首次對(duì)東北當(dāng)歸屬六種植物進(jìn)行了四種DNA條形碼鑒定的序列篩選；發(fā)現(xiàn)IST2片段在東北當(dāng)歸屬物種鑒定中能起到關(guān)鍵性作用，依據(jù)鑒定結(jié)果與該屬植物中的系統(tǒng)進(jìn)化地位，可對(duì)易混淆和替代現(xiàn)象提供科學(xué)的闡述和鑒定依據(jù)。