王偉恒，孫子杰，黃曉東，孟慶溪，葉曉健

1.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院骨科，上海 200003

2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第904醫(yī)院骨科，無錫 214000

3.中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院骨科，廣州 440104

4.中國人民解放軍第960醫(yī)院骨科，濟(jì)南 250000

椎間盤造影術(shù)是將造影劑注入椎間盤，利用影像學(xué)手段觀察椎間盤的形態(tài)，反映椎間盤的病理特征［1］。作為一種侵入性的有創(chuàng)診斷技術(shù)，椎間盤造影術(shù)一直存在爭(zhēng)議［2］。然而，椎間盤造影術(shù)具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，如典型的疼痛復(fù)制、直觀地顯示椎間盤損傷程度等［3］，其臨床應(yīng)用仍十分廣泛。近年來，椎間盤造影對(duì)椎間盤退行性變的影響倍受重視。臨床研究表明，椎間盤造影可加速腰椎椎間盤退行性變的進(jìn)展［4］。體內(nèi)研究表明，椎間盤造影和椎間盤阻滯可顯著增加椎間盤內(nèi)細(xì)胞的凋亡［5］。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，局部麻醉藥和非離子型造影劑對(duì)纖維環(huán)細(xì)胞和髓核細(xì)胞均有不利影響［6］。目前關(guān)于椎間盤造影術(shù)中注射造影劑劑量及注射速度仍沒有明確的標(biāo)準(zhǔn)，且存在很大爭(zhēng)議［7-9］，本研究通過觀察椎間盤造影過程中造影劑劑量對(duì)大鼠尾椎椎間盤退行性變的影響，為評(píng)估椎間盤造影術(shù)的臨床價(jià)值和風(fēng)險(xiǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10只3月齡雄性SD大鼠（海軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體質(zhì)量（350±50）g。選擇3月齡的雄性SD大鼠是因?yàn)榇藭r(shí)大鼠骨骼趨于成熟，以盡量減少年齡增長(zhǎng)引起的實(shí)驗(yàn)誤差［10］。每籠2只分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度（25±1）℃，12 h/12 h晝夜循環(huán)，自由飲食，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境至少1周。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批備案。

1.2 模型建立

正常成人椎間盤內(nèi)髓核容積約為3 mL，而臨床中使用的常規(guī)椎間盤內(nèi)注射劑量為2 mL。成年大鼠尾椎椎間盤的平均椎間盤高度為0.94 mm，髓核面積為3.30 mm2，總髓核體積為3.10 mm3［11］。因此，本研究選擇2 μL模擬臨床椎間盤造影中的常規(guī)注射劑量，選擇3 μL即大鼠尾椎椎間盤的極限容積作為高劑量。

將實(shí)驗(yàn)大鼠用10%的水合氯醛以30 mL/kg的劑量麻醉。選取尾部4個(gè)椎間盤為研究對(duì)象：Co6/Co7為空白組，不行任何處理；Co7/Co8為對(duì)照組，以30號(hào)穿刺針刺入椎間盤但不進(jìn)行注射；Co8/Co9為常規(guī)劑量組，以30號(hào)穿刺針注入2 μL碘海醇（歐乃派克，含碘質(zhì)量濃度300 mg I/mL，質(zhì)量滲透摩爾量為780 mOsm/kg，上海通用電氣藥業(yè)有限公司）；Co9/Co10為高劑量組，以30號(hào)穿刺針注入3 μL碘海醇。所有穿刺操作均在X線引導(dǎo)下完成，穿刺針方向平行于所選椎間隙的上下終板，以醫(yī)用止血鉗控制進(jìn)入椎間盤的導(dǎo)針長(zhǎng)度為5 mm（圖1a、b）。碘海醇的注入使用3 μL微量注射器（Hamilton，瑞士），注射完畢后將導(dǎo)針滯留于椎間盤內(nèi)2 min以防止液體滲漏。

1.3 X線檢查

椎間盤造影后2周及4周，使用X線檢測(cè)椎間盤高度指數(shù)（DHI）的變化。將大鼠用濃度10%的水合氯醛以30 mL/kg的劑量經(jīng)腹部注射麻醉，使大鼠尾部肌肉松弛以便觀察。使用X線拍攝大鼠尾椎椎間盤高度。采用Han等［12］提出的方法測(cè)量DHI，即DHI（%）=2×（D+E+F）/（A+B+C+G+H+I）×100%，其中A、B、C分別為上位椎體前緣、中點(diǎn)和后緣的高度，D、E、F分別為椎間隙前緣、中點(diǎn)和后緣的高度，G、H、I分別為下位椎體前緣、中點(diǎn)和后緣的高度（圖1c）。所有圖像均由2名對(duì)樣本不知情的獨(dú)立觀察者測(cè)量。通過Sante DICOM Viewer FREE圖像軟件分析DHI的變化。

1.4 MRI檢查

椎間盤造影后2周及4周使用MRI對(duì)大鼠尾椎椎間盤信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。將大鼠用10%水合氯醛以30 mL/kg的劑量麻醉，使尾部肌肉松弛以便觀察。采用3.0 T小動(dòng)物MRI機(jī)（飛利浦，荷蘭）對(duì)椎間盤進(jìn)行薄層掃描，以T2加權(quán)像評(píng)估椎間盤信號(hào)改變情況［13］。所有測(cè)量均由2名醫(yī)師各自獨(dú)立進(jìn)行，不同時(shí)間段椎間盤信號(hào)強(qiáng)度變化應(yīng)用NIH Image軟件進(jìn)行分析。

圖1 X線引導(dǎo)下椎間盤造影及DHI測(cè)量Fig. 1 Discography guided by roentogenography and DHI measurement

1.5 椎間盤含水量的測(cè)定

椎間盤造影4周后，隨機(jī)取5只大鼠，將大鼠腹腔注射高濃度水合氯醛麻醉處死，分離椎間盤與周圍軟組織，然后迅速置于-20℃液氮中冷凍。10 min后取出冷凍的椎間盤，使用精度為0.01 mg的電子秤稱得其濕質(zhì)量（WW）。再將椎間盤置于65℃烘箱中脫水24 h，用同一臺(tái)電子秤稱得其干質(zhì)量（DW）。每次稱量均重復(fù)3次，取平均值。椎間盤含水量（%）=（WW-DW）/WW×100%。

1.6 組織學(xué)檢查

影像學(xué)數(shù)據(jù)采集完畢后，將另外5只大鼠腹腔注射高濃度水合氯醛麻醉處死，迅速取出Co6/Co7/Co8/Co9/Co10椎間盤組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，用無菌蒸餾水沖洗后放入EDTA中脫鈣48 h，經(jīng)不同梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，沿平行于椎間盤軟骨排列的方向進(jìn)行5 μm連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色。使用HE組織學(xué)評(píng)分評(píng)估椎間盤退行性變的程度［14］。椎間盤退行性變組織學(xué)評(píng)分為0～6分。纖維環(huán)評(píng)分：0分，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)完整、無破損；1分，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)有破損，但小于整體纖維環(huán)的30%；2分，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)有破損，且大于整體纖維環(huán)的30%；3分，纖維環(huán)完全破損。髓核評(píng)分：0分，有典型的含有大空泡狀結(jié)構(gòu)的髓核細(xì)胞散在分布；1分，髓核細(xì)胞數(shù)量下降低于總細(xì)胞數(shù)的50%，存在或不存在細(xì)胞集聚；2分，髓核細(xì)胞數(shù)量中度至嚴(yán)重（＞50%）下降，且增殖性結(jié)締組織占據(jù)小于50%總面積；3分，髓核中增殖性結(jié)締組織占據(jù)大于50%總面積。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并使用Graphpad Prism 5軟件作圖。數(shù)據(jù)采用表示，使用單因素方差分析比較組間差異，多重比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)；以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 造影劑劑量對(duì)椎間盤DHI的影響

術(shù)后2周和4周時(shí)，與空白組相比，對(duì)照組DHI未見明顯變化，常規(guī)劑量組和高劑量組DHI降低，且高劑量組比常規(guī)劑量組降低更為顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖2）。

圖2 X線檢測(cè)造影劑劑量對(duì)椎間盤DHI的影響Fig. 2 Effect of contrast agent dose on DHI of intervertebral disc detected by roentgenography

2.2 造影劑劑量對(duì)椎間盤信號(hào)改變的影響

術(shù)后2周和4周時(shí)MRI檢測(cè)示，與空白組相比，對(duì)照組、常規(guī)劑量組和高劑量組椎間盤信號(hào)均降低，且劑量越大信號(hào)越低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖3）。

圖3 MRI檢測(cè)造影劑劑量對(duì)椎間盤信號(hào)強(qiáng)度的影響Fig. 3 Effect of contrast agent dose on signal intensity of intervertebral disc detected by MRI

2.3 造影劑劑量對(duì)椎間盤含水量的影響

椎間盤造影術(shù)后4周，與空白組相比，對(duì)照組椎間盤含水量未見明顯變化，常規(guī)劑量組和高劑量組椎間盤含水量降低，且高劑量組降低更為顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖4）。

圖4 造影劑劑量對(duì)椎間盤含水量的影響Fig. 4 Effect of contrast agent dose on water content of intervertebral disc

2.4 造影劑劑量對(duì)椎間盤組織學(xué)評(píng)分的影響

椎間盤造影術(shù)后4周，通過HE染色檢測(cè)椎間盤組織學(xué)變化（圖5）。結(jié)果顯示，空白組和對(duì)照組未見明顯組織病理學(xué)改變，而常規(guī)劑量組和高劑量組椎間盤組織病理學(xué)改變明顯，纖維環(huán)結(jié)構(gòu)有破損，髓核細(xì)胞數(shù)量減少。病理組織學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示，常規(guī)劑量組和高劑量組椎間盤病理組織學(xué)評(píng)分高于空白組，且高劑量組病理組織學(xué)評(píng)分高于常規(guī)劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，圖6）。

圖5 HE染色Fig. 5 HE staining

圖6 造影劑劑量對(duì)椎間盤組織學(xué)評(píng)分的影響Fig. 6 Effect of contrast agent dose on histological score of intervertebral disc

3 討 論

根據(jù)分子結(jié)構(gòu)分類，造影劑可分為離子型和非離子型。離子型造影劑因其不良反應(yīng)發(fā)生率高、肌體耐受性差而逐漸被非離子型造影劑所取代。非離子型造影劑也有一定的毒性，不同種類的非離子造影劑的細(xì)胞毒性不盡相同，可能與造影劑的滲透壓和黏度相關(guān)［6，15-17］。碘海醇屬于第二代非離子型造影劑，目前在臨床上應(yīng)用最為廣泛，也是臨床椎間盤造影常用的造影劑［18］。體外細(xì)胞研究表明，碘海醇具有一定的細(xì)胞毒性［19］。本研究在大鼠體內(nèi)就造影劑劑量對(duì)椎間盤退行性變的影響進(jìn)行研究，于造影術(shù)后2周和4周分別對(duì)椎間盤的退行性變程度進(jìn)行評(píng)估，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括DHI、MRI信號(hào)強(qiáng)度、椎間盤含水量和椎間盤組織學(xué)改變，證明了椎間盤造影中造影劑劑量對(duì)椎間盤退行性變的影響，為評(píng)估臨床椎間盤造影技術(shù)的價(jià)值和風(fēng)險(xiǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究證明，在動(dòng)物體內(nèi)碘海醇可以引起椎間盤退行性變，并且注射劑量越大，椎間盤退行性變?cè)矫黠@。椎間盤是人體最大的無血管組織，通過被動(dòng)擴(kuò)散完成營養(yǎng)和物質(zhì)更新，椎間盤內(nèi)存在特殊的高滲環(huán)境（430 ～ 496 mOsm/kg）［20-21］。本研究使用的碘海醇為上海通用電氣藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，規(guī)格為300 mg I/mL，滲透壓為780 mOsm/kg，明顯高于椎間盤的滲透壓。且由于椎間盤是無血管器官，注射的碘海醇可以較長(zhǎng)時(shí)間殘存在椎間盤內(nèi)，隨著碘海醇注入量的增加，其對(duì)椎間盤的影響也較大。椎間盤退行性變的程度還和椎間盤的靜水壓有關(guān)。體內(nèi)外研究已經(jīng)清楚地表明，靜水壓可以顯著影響細(xì)胞外基質(zhì)成分、細(xì)胞合成代謝蛋白的活力和基因的表達(dá)［22-25］。碘海醇劑量對(duì)椎間盤退行性變的影響可能包括兩方面原因：①在密閉的椎間盤內(nèi)注射碘海醇體積越大，密閉椎間盤的靜水壓越高，導(dǎo)致椎間盤退行性變的程度越高；②碘海醇為高滲液體且具有細(xì)胞毒性，注射體積越大，高滲且有細(xì)胞毒性的溶液的量越大，椎間盤的退行性變程度也越大。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，僅進(jìn)行穿刺針刺入而不進(jìn)行注射的對(duì)照組MRI椎間盤信號(hào)也較未進(jìn)行任何處理的空白組降低，說明針刺本身也可導(dǎo)致椎間盤退行性變。

本研究的不足之處包括以下幾點(diǎn)。①僅從造影劑的劑量角度探討椎間盤造影對(duì)椎間盤退行性變的影響，還有其他造成椎間盤退行性變的因素需要考慮，如穿刺針的直徑、椎間盤尺寸（纖維環(huán)的厚度）、操作者的技術(shù)熟練程度、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的營養(yǎng)狀態(tài)及其他未知因素［26-27］。②研究對(duì)象為正常大鼠尾椎椎間盤，未研究椎間盤造影術(shù)對(duì)已經(jīng)發(fā)生退行性變的椎間盤的影響，這和臨床中椎間盤造影術(shù)的應(yīng)用有所差異。主要基于兩方面考慮：一方面，臨床標(biāo)準(zhǔn)的椎間盤造影診斷技術(shù)需要1 ～ 2個(gè)鄰近節(jié)段的椎間盤造影作為陰性對(duì)照，研究椎間盤造影術(shù)對(duì)正常椎間盤的影響可有效評(píng)估陰性對(duì)照的價(jià)值和風(fēng)險(xiǎn)；另一方面，考慮到椎間盤退行性變?cè)炷r(shí)，為避免模型的退行性變基線不盡相同造成系統(tǒng)誤差，故使用正常椎間盤。③以大鼠椎間盤作為研究對(duì)象，大鼠尾椎椎間盤退行性變?cè)炷＜夹g(shù)成熟，操作簡(jiǎn)便，安全性高，可重復(fù)性強(qiáng)，但大鼠椎間盤結(jié)構(gòu)及髓核細(xì)胞形態(tài)、生理功能和人體有差異，且大鼠椎間盤內(nèi)的滲透壓和人體不盡相同，因此，碘海醇造成的大鼠椎間盤退行性變和人體實(shí)際情況存在差異。但因倫理等實(shí)際操作問題，本研究未將人體作為研究對(duì)象。造影劑劑量對(duì)人椎間盤退行性變的影響有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，造影劑可引發(fā)椎間盤退行性變，且劑量越大，椎間盤退行性變的程度越高。因此，在進(jìn)行椎間盤造影時(shí)，應(yīng)當(dāng)充分考慮造影劑劑量對(duì)椎間盤的影響，盡量減少造影劑的使用量，以使其對(duì)椎間盤的影響最小化。