于秀菊，孫 錚，韓小濤，李鈺鈺

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌等有益芽孢桿菌是我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定的可直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑。芽孢桿菌(Bacillus sp.)是一類好氧型或兼性厭氧型革蘭氏陽性菌，是動植物微生態(tài)的優(yōu)勢菌之一，不僅種類繁多，而且來源廣泛，在土壤、水體、空氣及動物腸道中都存在[1-2]。芽孢桿菌也是抑菌物質(zhì)的生產(chǎn)者，其產(chǎn)生的細(xì)菌素是繼乳酸菌細(xì)菌素之后的又一類主要的細(xì)菌素，與乳酸菌研究最多的Nisin相比，該類細(xì)菌素在耐受性方面表現(xiàn)突出[3]，已作為益生菌廣泛應(yīng)用于食品、水產(chǎn)養(yǎng)殖、醫(yī)藥和生物農(nóng)藥等領(lǐng)域。研究數(shù)據(jù)顯示，在過去的5年中，研究人員從多種樣品中篩選出有益芽孢桿菌，并分離純化出新的細(xì)菌素。有益芽孢桿菌的開發(fā)和應(yīng)用可能是解決抗生素問題的一個有效方案。

1 菌株

菌株P(guān)B-2為筆者所在研究小組在前期試驗中從呂梁黑豬腸道中分離純化得到的。大腸桿菌、沙門菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和藤黃微球菌保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)實驗室。

牛津杯法抑菌實驗所用下層板為2%瓊脂。上層板用的是含有107 CFU/mL指示菌的0.75% TSA培養(yǎng)基(胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，氯化鈉30 g，瓊脂7.5 g，水1 000 mL)或15 mL 0.75%的BHI(腦心浸液)培養(yǎng)基，待上層凝固后，將一定間隔放置的牛津杯拔出，形成上層板。

2 方法

2.1 菌株的活化和抑菌活性檢測

將－80 ℃保存的PB-2甘油菌活化后，按照1∶100的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，10 000 g，4 ℃下離心20 min，收集上清液，用0.22 μm濾器過濾獲得無細(xì)胞的培養(yǎng)上清。運用牛津杯法檢測其抑菌活性[4]。

2.2 PB-2菌株的鑒定

菌落形態(tài)：將菌株P(guān)B-2劃線接種于LB平板上，培養(yǎng)12 h，觀察單菌落的形態(tài)特征。

革蘭氏染色：參考革蘭氏染色試劑盒的說明書進(jìn)行革蘭氏染色，在Leica DMIRB顯微鏡油鏡下觀察PB-2的形態(tài)。

16S rDNA法鑒定：以提取的菌體DNA作為模板，采用16S通用引物進(jìn)行PCR擴增，上下游引物序列分別為：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。將擴增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。運用NCBI的BLAST進(jìn)行比對，分析分離菌的同源性，鑒定其菌種歸屬。

3 結(jié)果

3.1 菌株P(guān)B-2的抑菌活性

菌株P(guān)B-2的發(fā)酵上清對革蘭氏陽性菌具有明顯的抑菌活性(表1)。

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3.2 菌株P(guān)B-2的鑒定

PB-2菌落呈白色略帶黃色，菌落邊緣不整齊，表面不光滑且不透明，形成“黏液狀的花形”菌落形態(tài)(圖1A)；經(jīng)革蘭氏染色后，油鏡下觀察可見菌株P(guān)B-2呈紫色短桿狀，細(xì)胞單個或成對存在(圖1B)；PB-2的PCR擴增產(chǎn)物大小為1 400 bp，瓊脂糖電泳結(jié)果見圖1C；將PB-2 16S rRNA測序結(jié)果與NCBI的BLAST進(jìn)行比對，結(jié)果顯示該菌株與Bacillus licheniformis16S rRNA基因序列相似度高達(dá)99%。

4 討論

自然界蘊藏著豐富的可維持菌群平衡的益生菌資源[5]。本文對從呂梁黑豬腸道中分離的一株細(xì)菌PB-2進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其對革蘭氏陽性菌具有明顯的抑菌活性，通過細(xì)菌染色和形態(tài)學(xué)觀察初步鑒定為芽孢桿菌。根據(jù)文獻(xiàn)報道，16S rDNA序列同源性大于99%，可以認(rèn)為屬于同一種；同源性為95%～98%可以認(rèn)為是同屬不同種；同源性在95%以下可以認(rèn)為屬于不同屬。本文根據(jù)菌株P(guān)B-2的16S rDNA鑒定結(jié)果確定該菌株為地衣芽孢桿菌。

瓊脂擴散方法是分離和篩選具有拮抗作用微生物的最經(jīng)典的方法[6]，在分離和篩選動物、植物和環(huán)境來源的拮抗微生物方面得到了普遍的應(yīng)用。Ren等利用該方法從發(fā)酵乳中分離到具有拮抗作用的乳酸菌[7]；Ge等運用瓊脂擴散方法從泡菜中分離到副干酪乳桿菌，并從該菌中純化得到新型細(xì)菌素HD1-7[8]。本試驗采用這種方法，對分離到的PB-2進(jìn)行抑菌活性測定，結(jié)果表明該菌株對金黃色葡萄球菌、李斯特菌具有抑制效果。