溫智勇 夏金金 江偉強(qiáng)

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州 510280)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，隨著大量蛋白尿漏出，腎功能漸進(jìn)性損害，逐漸進(jìn)展至腎衰竭、尿毒癥等，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[1]。其臨床特征主要是蛋白尿、血尿、水腫、高血壓，疾病進(jìn)展可引起腎衰竭，對(duì)患者生命安全及生活質(zhì)量影響嚴(yán)重，在疾病發(fā)展過程中需要及早采取有效藥物治療[2]。常規(guī)治療主要采取降糖、降壓、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)類藥物干預(yù)及低鹽低脂優(yōu)質(zhì)低蛋白飲食管理等綜合方案,但效果往往不盡如人意[3]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼RNA，研究表明與糖尿病腎臟纖維化、微血管病變密切相關(guān)[4]。miRNA的發(fā)現(xiàn)揭示了一種新的基因表達(dá)調(diào)控方式,即不同miRNA和靶基因之間能夠形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),發(fā)揮精細(xì)調(diào)控作用[5]。腎康丸是我院研制的中成藥，具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、散風(fēng)利濕、補(bǔ)腎固澀的功效，用于治療早期氣陰兩虛型DN。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)腎康丸能顯著降低DN大鼠腎臟組織微小RNA-192(miR-192)含量，抑制腎臟纖維化，但在臨床研究中尚未進(jìn)一步證實(shí)。舒洛地特能顯著改善DN患者腎功能[6]，延緩疾病進(jìn)展，但舒洛地特聯(lián)合腎康丸是否能產(chǎn)生協(xié)同作用，降低尿miR-192尚未可知。2018-07—2019-01，我們采用腎康丸聯(lián)合舒洛地特軟膠囊治療DN患者40例，并與單純腎康丸、舒洛地特軟膠囊各治療40例對(duì)照，觀察臨床療效及對(duì)尿miR-192、血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、Smad蛋白1(Smad1)、Smad蛋白2(Smad2)的影響，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 全部120例均為南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院內(nèi)科住院DN患者，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組。治療組40例，男21例，女19例；年齡45～51歲，平均(49.1±2.6)歲；1型糖尿病18例，2型糖尿病22例；糖尿病病程2.5～8.5年，平均(5.4±2.1)年。對(duì)照1組40例，男23例，女17例；年齡44～51歲，平均(48.2±3.2)歲；1型糖尿病19例，2型糖尿病21例；糖尿病病程1～8.5年，平均(5.2±1.0)年；DN病程2～6.5年，平均(3.5±2.2)年；DN分期：3期23例，4期17例。對(duì)照2組40例，男26例，女14例；年齡45～52歲，平均(48.5±3.0)歲；1型糖尿病21例，2型糖尿病19例；糖尿病病程1.5～9.5年，平均(5.4±1.4)年；DN病程2.2～6.3年，平均(3.7±2.4)年；DN分期：3期21例，4期19例。3組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 病例選擇

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《中國(guó)糖尿病腎病防治專家共識(shí)(2014年版)》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)，DN分期為3～4期。

1.2.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 參照《糖尿病腎病中醫(yī)診療標(biāo)準(zhǔn)(2011年)》[8]辨證為氣陰兩虛型，證見尿濁，神疲乏力，氣短懶言，咽干口燥，頭暈多夢(mèng)，或尿頻尿多，手足心熱，心悸不寧，舌體瘦薄，質(zhì)紅或淡紅，苔少而干，脈沉細(xì)無(wú)力。需由2名副主任中醫(yī)師以上進(jìn)行中醫(yī)證型判定，如有爭(zhēng)議者再由主任中醫(yī)師進(jìn)行判定。

1.2.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 年齡≥18歲，符合上述西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)；糖尿病病程1～9.5年；空腹血糖(FPG)≥6.75 mmol/L。

1.2.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 腎臟實(shí)質(zhì)性病變?nèi)缒[瘤等；糖尿病伴發(fā)急性并發(fā)癥者；妊娠期或哺乳期婦女；伴嚴(yán)重臟器功能衰竭；伴精神類疾病者；合并全身或嚴(yán)重慢性疾病患者；研究過程中中斷治療、死亡患者。

1.3 治療方法 全部患者均進(jìn)行糖尿病健康宣教，同時(shí)予降糖、降壓、調(diào)脂以及其他對(duì)癥治療。

1.3.1 對(duì)照1組 腎康丸(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥劑科制劑，粵藥制字Z20110193,生產(chǎn)批號(hào)170807)1包，每日2次口服。

1.3.2 對(duì)照2組 舒洛地特軟膠囊(意大利阿爾法韋士曼制藥公司，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)H20140119)250 LSU，每日2次口服。

1.3.3 治療組 予腎康丸聯(lián)合舒洛地特軟膠囊治療，方法同上。

1.3.4 療程 3組均治療6個(gè)月。

1.4 觀察指標(biāo) 3組治療前后均取晨尿3 mL，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)尿miR-192；3組治療前后均清晨空腹取靜脈血，留取24 h尿液,采用PUZS-300X全自動(dòng)生化分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)檢測(cè)FPG、糖化血紅蛋白(HbA1c)、24 h尿蛋白定量(24 h UP)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)、尿白蛋白排泄率(UAER)、胱抑素C(Cys-C)，并用EPI公式計(jì)算估測(cè)估算腎小球?yàn)V過率(eGFR)[9]，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、TGF-β1、Smad1、Smad2蛋白含量。

1.5 療效標(biāo)準(zhǔn) 顯效：臨床癥狀消失，尿miR-192顯著降低，24 h UP降至正?；蛳陆?/2以上，F(xiàn)PG、HbA1c下降超過1/2或恢復(fù)正常，腎功能正常；有效：臨床癥狀較治療前好轉(zhuǎn)，尿miR-192、FPG、HbA1c有所下降，但不足顯效標(biāo)準(zhǔn)，24 h UP較治療前下降不到1/2，腎功能正常；無(wú)效：臨床癥狀未改善或惡化，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)無(wú)變化或升高[10]?？傆行?(顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 3組治療前后尿miR-192及血清TGF-β1、血清Smad1、血清Smad2表達(dá)比較 見表1。

表1 3組治療前后尿miR-192及血清TGF-β1、血清Smad1、血清Smad2表達(dá)比較

由表1可見，治療后3組尿miR-192及血清TGF-β1、血清Smad1、血清Smad2表達(dá)均較本組治療前降低(P<0.05)，且治療后治療組尿miR-192，血清TGF-β1、Smad2均低于對(duì)照1組、對(duì)照2組(P<0.05)。

2.2 3組治療前后FPG、HbA1c比較 見表2。

表2 3組治療前后FPG、HbA1c比較

由表2可見，治療后3組FPG、HbA1c均較本組治療前降低(P<0.05)，且治療后治療組均低于對(duì)照1組、對(duì)照2組(P<0.05)。

2.3 3組治療前后TNF-α、IL-6比較 見表3。

表3 3組治療前后TNF-α、IL-6比較

由表3可見，治療后3組TNF-α、IL-6均較本組治療前降低(P<0.05)，且治療后治療組均低于對(duì)照1組、對(duì)照2組(P<0.05)。

2.4 3組治療前后24 h UP及腎功能指標(biāo)比較 見表4。

表4 3組治療前后24 h UP及腎功能指標(biāo)比較

由表4可見，治療后3組24 h UP、BUN、Cr、Cys-C均較本組治療前降低(P<0.05)，eGFR均升高(P<0.05)，且治療后治療組24 h UP、BUN、Cr、Cys-C均低于對(duì)照組1組、對(duì)照2組(P<0.05)，eGFR高于對(duì)照1組、對(duì)照2組(P<0.05)。3組UAER治療前后比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 3組臨床療效比較 見表5。

表5 3組臨床療效比較 例

由表5可見，治療組總有效率高于對(duì)照1組、對(duì)照2組(P<0.05)，對(duì)照1組、對(duì)照2組總有效率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 治療組尿miR-192水平與糖尿病病程及其他各臨床檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性分析 見表6。

表6 治療組尿miR-192水平與糖尿病病程及其他各臨床檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性分析

由表6可見，治療組患者治療前后尿miR-192表達(dá)下降與Cr、Cys-C、BUN、Smad1、TGF-β1呈正相關(guān)(P<0.05)，而與糖尿病病程、FPG、HbA1c無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

3 討 論

糖尿病容易并發(fā)DN[11]，已經(jīng)成為我國(guó)終末期腎病的第2位病因[12],僅次于各種腎小球腎炎。因其存在復(fù)雜的代謝紊亂現(xiàn)象,故一旦發(fā)展成為終末期腎病,往往比其他腎病更為難治,因此及時(shí)防治對(duì)于延緩DN發(fā)展意義重大。舒洛地特化學(xué)名稱為葡糖醛酸基葡糖胺聚糖硫酸鹽，由80%的低分子肝素和20%的硫酸皮膚素組成，是一種高度提純的天然葡萄糖胺聚糖，可以保護(hù)腎小球?yàn)V過屏障，抗氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)，抑制系膜細(xì)胞增殖及基質(zhì)增多。臨床研究發(fā)現(xiàn)，舒洛地特能夠顯著減少老年DN蛋白尿，延緩腎臟病進(jìn)展，但對(duì)于患者血壓、FPG、HbA1c、Cr、肌酐清除率無(wú)明顯作用。

中醫(yī)藥在防止DN的發(fā)展、延緩腎功能惡化等方面取得較好的成效[13]。DN屬中醫(yī)學(xué)“消渴腎病”范疇，其病位主要在脾腎。飲食失調(diào)，稟賦不足，勞欲過度，情志失調(diào)為基本病因。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，虛、瘀、痰、毒是DN主要病機(jī)，虛為病機(jī)之首，腎虛絡(luò)損導(dǎo)致腎絡(luò)瘀阻，邪阻腎絡(luò)，郁久蘊(yùn)毒，深滯于浮絡(luò)，致本病病情纏綿，久治不愈[14]。DN特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛為氣血陰陽(yáng)、五臟虧虛，標(biāo)實(shí)為血瘀、痰瘀、濕阻、水停等。本病主要治療原則為益氣活血，補(bǔ)腎固攝，脾腎充足，則病邪可解。腎康丸的主要由黃芪、芡實(shí)、金櫻子、水蛭、益母草、玉米須、蟬蛻、山楂組成。方中重用黃芪補(bǔ)一身之氣，利水消腫為君藥；芡實(shí)、金櫻子補(bǔ)脾益腎，固攝精微為臣藥；水蛭破血逐瘀，攻逐久積之瘀滯；益母草活血祛瘀，利水消腫；玉米須利尿?yàn)a熱；蟬蛻宣肺散風(fēng)熱，共為佐藥；山楂消積化滯，以防大劑量黃芪之壅滯為使藥。諸藥配伍，使肺、脾、腎氣虛得復(fù)，濕利瘀祛，精微封藏，諸癥自可漸愈。前期藥理研究已發(fā)現(xiàn)，腎康丸能保護(hù)DN大鼠足細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的完整性，從而減少蛋白尿漏出，還能有助于降糖[15]，但腎康丸尚缺乏有效的臨床研究數(shù)據(jù)支持。

miRNA是一類細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)源性非編碼微小單鏈miRNA，參與了細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育及凋亡、免疫應(yīng)答等各個(gè)方面[16]。miR-192是miRNA的一種，相對(duì)于其他器官，miR-192在腎臟有較高的表達(dá)，富集于腎皮質(zhì)。有研究表明miR-192在腎臟及肝臟纖維化過程中發(fā)揮重要作用[17]。TGF-β1是一種多功能的細(xì)胞因子,在DN發(fā)病中起著非常重要的作用，能促使腎臟固有細(xì)胞發(fā)生增殖、肥大,增加系膜細(xì)胞(MC)合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM),并通過增加基質(zhì)降解酶抑制物活性而減少ECM的降解[18]。miR-192作為在腎臟特異性表達(dá)的miRNA之一,可以經(jīng)由TGF-β1介導(dǎo)通路參與DN的ECM蛋白蓄積進(jìn)程,可能機(jī)制為：TGF-β1正調(diào)節(jié)miR-192,miR-192減量調(diào)節(jié)Smad相互作用蛋白1(SIP1),導(dǎo)致Ⅰ型膠原(CollgenⅠ)過度表達(dá),蛋白蓄積。TGF-β1、Smad1、Smad2均是腎臟纖維化的關(guān)鍵作用蛋白[19]。TGF-β1誘導(dǎo)miR-192表達(dá)的機(jī)制尚待進(jìn)一步探討,有證據(jù)顯示miR-192啟動(dòng)子存在高度保守的上游區(qū)Ets-1原癌基因結(jié)合位點(diǎn),而TGF-β1也誘導(dǎo)調(diào)控Ets-1表達(dá),Ets-1在腎臟發(fā)育、保持腎小球完整性及基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)中都是必需的,由此推斷,TGF-β1可能是通過Ets-1調(diào)控miR-192。尿miR-192的研究發(fā)現(xiàn)，DN患者尿miR-192表達(dá)顯著高于正常人，血、尿miR-192的異常表達(dá)與腎臟纖維化密切相關(guān)[20]。而且隨著尿中蛋白水平的增加，其表達(dá)也增加[21]。由此可見，DN患者尿miR-192的表達(dá)升高常提示病情進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，治療后3組尿miR-192、血清TGF-β1、血清Smad1、血清Smad2表達(dá)均降低(P<0.05)，且治療后治療組尿miR-192、TGF-β1、Smad2均低于對(duì)照1組、對(duì)照2組(P<0.05)。提示腎康丸、舒洛地特均能顯著改善DN患者腎臟纖維化，但聯(lián)合應(yīng)用效力更強(qiáng)。而且通過相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)，治療組患者尿miR-192下降與DN患者血清Cr、Cys-C、BUN、Smad1、TGF-β1呈正相關(guān)，提示腎康丸聯(lián)合舒洛地特降低氣陰兩虛型DN患者尿miR-192與抑制腎臟TGF-β1/Smad1導(dǎo)致的腎臟纖維化相關(guān)，與前期的實(shí)驗(yàn)研究[22]結(jié)果一致。

有研究顯示，TNF-α通過多種機(jī)制引起DN腎臟損傷,包括損傷腎小球通透屏障,改變腎臟局部血流動(dòng)力學(xué),促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖及系膜外基質(zhì)沉積,正調(diào)節(jié)免疫炎性反應(yīng)[23]。IL-6被認(rèn)為是高糖環(huán)境中或糖尿病狀態(tài)下多種生理生化改變導(dǎo)致DN的中介物質(zhì)，胰島素抵抗及胰島素分泌不足引起的高血糖均可促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌IL-6，可引起病理?yè)p傷[24]。本研究結(jié)果顯示，治療組臨床療效優(yōu)于對(duì)照1組、對(duì)照2組(P<0.05)。治療后3組FPG、HbA1c均降低(P<0.05)，且治療后治療組均低于對(duì)照1組、對(duì)照2組(P<0.05)。治療后3組TNF-α、IL-6均降低(P<0.05)，且治療后治療組均低于對(duì)照1組、對(duì)照2組(P<0.05)。治療后3組24 h UP、BUN、Cr、Cys-C均降低(P<0.05)，eGFR均升高(P<0.05)，且治療后治療組改善均優(yōu)于對(duì)照1組、對(duì)照2組(P<0.05)。提示單用舒洛地特或腎康丸均能顯著改善蛋白尿，降低Cr、eGFR，減少炎癥介質(zhì)，但聯(lián)用的治療組相較于對(duì)照1組和對(duì)照2組降低蛋白尿、改善腎功能及改善炎癥指標(biāo)的效應(yīng)更為顯著，提示舒洛地特聯(lián)合腎康丸具有很好的協(xié)同作用，能進(jìn)一步改善氣陰兩虛型DN患者腎功能，降低炎性反應(yīng)。

綜上所述，腎康丸聯(lián)合舒洛地特治療相較于單純舒洛地特或腎康丸治療氣陰兩虛型DN療效更佳，可降低DN患者的尿miR-192表達(dá)、尿蛋白，改善腎功能及炎癥狀態(tài)，療效顯著，值得推廣應(yīng)用。