張亞娟 高習(xí)文 吳福紅

1復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,上海201199;2上海市第六人民醫(yī)院金山分院血液腫瘤科201599

肺癌是目前全球發(fā)病率最高、致死率最高的男性和女性惡性腫瘤。根據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計報告,肺癌占全部腫瘤發(fā)病率的11.6%,占全部腫瘤死亡率的18.4%[1]。肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌,其中非小細(xì)胞肺癌約占85%以上。非小細(xì)胞肺癌的病理類型主要分為腺癌和鱗癌。肺腺癌約占肺部腫瘤的40%,其最重要的風(fēng)險因素是吸煙[2]。目前,手術(shù)切除、放射治療及化學(xué)治療仍是肺腺癌最常見的治療方法,但療效并不理想,患者5 年生存率僅為15%[1,3]。因此,發(fā)現(xiàn)新的肺癌分子標(biāo)志物有助于肺腺癌的早期診斷、靶向治療和預(yù)防。

線粒體單鏈DNA 結(jié)合蛋白1 (mitochondrial single-strand binding pr otein 1,SSBP1)是線粒體DNA 合成的關(guān)鍵分子,調(diào)控線粒體DNA 復(fù)制、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄,影響線粒體的生物學(xué)功能,調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生理功能[4]。目前發(fā)現(xiàn)SSBP1與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[5-8],但SSBP1在肺癌中的表達(dá)情況及其生物學(xué)功能尚不清楚。本研究探索SSBP1在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基購自美國Hy Clone公司;胎牛血清購自美國Gibco 公司;Opti-MEM 培養(yǎng)基及Lipofecta mine 2000購自美國Life Technologies 公司;CCK8 試劑盒購自美國Selleck 公司;SSBP1 兔多克隆抗體購自美國Proteintech 公司,兔抗人p-Akt和兔抗人Akt購自美國CST 公司,Actin 抗體購自美國sig maal drich公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 數(shù)據(jù)來源 數(shù)據(jù)均來源于TCGA 數(shù)據(jù)庫,包括肺腺癌和肺鱗癌數(shù)據(jù)集的mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)以及對應(yīng)的臨床資料數(shù)據(jù)。臨床資料包括生存時間、生存狀態(tài)和疾病分期等。

1.2 方法

1.2.1 基因表達(dá)分析 利用GEPIA 對TCGA 數(shù)據(jù)分析SSBP1 mRNA 的表達(dá)水平與肺癌患者分期和預(yù)后的關(guān)系。共分析483例肺腺癌組織及59例癌旁組織,486例肺鱗癌組織及50例癌旁組織。

1.2.2 p LVTH M-sh RNA SSBP1質(zhì)粒構(gòu)建 將質(zhì)粒載體p LVTHM 進(jìn)行Ml UⅠ和ClaⅠ雙酶切反應(yīng),DNA 純化回收試劑盒回收p LVTH M 片段,與合成的MRPL13靶序列退火產(chǎn)物連接,敲低SSBP1的靶序列為AGTTTGGTTCTTGAAAGAT,連接產(chǎn)物與100μl的DH5α感受態(tài)細(xì)菌混勻后轉(zhuǎn)化,挑取單克隆測序。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) HEK293T 和人肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱、RPMI 1640 完全培養(yǎng)基 (含10% 胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素)中培養(yǎng)。

1.2.4 病毒包裝與感染 0.25% 胰酶消化HEK293 T 細(xì)胞,接種10 c m 培養(yǎng)皿,待細(xì)胞密度達(dá)到90%時,細(xì)胞培養(yǎng)基換成無血清的培養(yǎng)基。含有12μg目的質(zhì)粒、3.6μg的p MD2 G 和9μg的ps PAX2病毒包裝輔助質(zhì)粒與不含血清的培養(yǎng)基混合,與含有60μl Lipofecta mine T M 2000的脂質(zhì)體混合液混合,加入HEK293T 細(xì)胞中,37 ℃培養(yǎng)6～8 h后,更換含有血清的RPMI1640 培養(yǎng)基。48 h后收集細(xì)胞上清液,細(xì)胞上清液與完全培養(yǎng)基1∶1 混合加入細(xì)胞融合度為60%的平皿中,并加入0.1%的凝聚胺,37 ℃培養(yǎng)6～8 h后換新鮮的RPMI1640完全培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)48 h后檢測感染效率。

1.2.5 q RT-PCR 根據(jù)NCBI上公布的各基因序列分別設(shè)計q RT-PCR 用引物。SSBP1 正向引物：5'-TGGAGTCGTGTGTTTTGGCT-3', 反向引物： 5'-TAGGCTTTTCCTGAAAACCGAGG-3';GAPDH 正向引物：5'-GTCGGAGTCAACGGATTTG-3',反向引物：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3';并由上海生物工程有限公司代為合成。Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA,按試劑盒說明書操作。根據(jù)Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),生成c DNA。進(jìn)行PCR 反應(yīng)。各基因?qū)?yīng) 正、反 向 引 物 各0.5 μl,SYBR Green Mix 10μl,c DNA 模板1.0μl,滅菌雙蒸水8μl。PCR反應(yīng) 程 序：95 ℃3 min;95 ℃5 s,56 ℃30 s,72 ℃25 s,35個循環(huán);65 ℃5 min;95 ℃50 s,選取GAPDH 為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCT表示各基因的相對表達(dá)量。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法 收集細(xì)胞,使用RIPA 細(xì)胞裂解液(含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)裂解細(xì)胞,4 ℃裂解30 min,12 000×g離心15 min,吸取上清,BCA 法檢測濃度,加上樣緩沖液,100 ℃水浴煮5 min,分裝后置于-80 ℃中。用10%SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì),之后轉(zhuǎn)印至PVDF膜,5%BSA 封閉2 h。膜與特定的一抗在4 ℃孵育過夜 (MRPL13,1∶400 稀釋)。TBST 洗膜3 次,每次10 min。加入相應(yīng)的二抗(1∶5 000稀釋)后在37 ℃孵育1 h。用TBST 洗膜3次,每次10 min。采用化學(xué)發(fā)光法檢測信號。

1.2.7 克隆平板實(shí)驗 細(xì)胞接種于6孔板中,每皿2 000個,37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d,棄去培養(yǎng)基,用多聚甲醛固定后,吉姆薩染色、相機(jī)拍照、計數(shù)。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.2.8 CCK8實(shí)驗 按104/孔的密度將細(xì)胞種于96孔板中,24 h 細(xì)胞貼壁后,加入10μl CCK-8溶液,37 ℃避光孵育1 h,檢測450 n m 吸光度,根據(jù)吸光度值繪制生長曲線。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0和GraphPad Prism6對各實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示,組內(nèi)比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SSBP1 mRNA 在肺癌中的表達(dá)水平 通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(483例肺腺癌組織及59例癌旁組織,486例肺鱗癌組織及50例癌旁組織)發(fā)現(xiàn),SSBP1 mRNA 的表達(dá)水平在肺腺癌、肺鱗癌組織中均明顯高于癌旁組織(P值均<0.05),見圖1。

圖1 SSBP1 mRNA 在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平 A：SSBP1 mRNA 在肺腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平;B：SSBP1 mRNA 在肺鱗癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平

2.2 SSBP1 mRNA 的表達(dá)水平與肺癌患者組織分期的關(guān)系 根據(jù)TCGA 數(shù)據(jù)庫,SSBP1 mRNA 的表達(dá)水平隨著肺腺癌分期的增加而增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.52,P<0.01);不同分期肺鱗癌的SSBP1 mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.07,P=0.36),見圖2。

2.3 SSBP1 mRNA 的表達(dá)水平與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 為了探討SSBP1對于肺腺癌患者預(yù)后的影響,采用TCGA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。根據(jù)SSBP1 mRNA 的表達(dá)水平,肺癌患者分成低表達(dá)組 (低于平均值)和高表達(dá)組 (高于平均值)。結(jié)果顯示高表達(dá)組肺腺癌患者總生存率和無病生存率均較低表達(dá)組縮短,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P值均<0.05)。但是,2組肺鱗癌患者總生存率和無病生存率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P值均>0.05)。見圖3。

2.4 陰性對照組與SSBP1敲低組抑制A549的增殖和克隆形成能力的比較 為了揭示SSBP1對肺腺癌細(xì)胞增殖的影響,我們通過慢病毒感染構(gòu)建了穩(wěn)定敲低SSBP1 的A549 細(xì)胞系,細(xì)胞被分成SSBP1敲低組和陰性對照組。通過CCK8 實(shí)驗和平板克隆實(shí)驗結(jié)果顯示,SSBP1敲低組A549細(xì)胞增殖和克隆形成能力均低于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=13.91、15.19,P值均<0.01)。見圖4。

圖2 SSBP1 mRNA 在肺癌不同分期組織中的表達(dá)水平 A：肺腺癌;B：肺鱗癌

2.5 陰性對照組與SSBP1敲低組Akt磷酸化水平比較 為了進(jìn)一步研究SSBP1對A549細(xì)胞增殖的影響,我們檢測了Akt的磷酸化水平,結(jié)果顯示SSBP1敲低后Akt的磷酸化水平顯著降低 (t=17.88,P=0.003),見圖5。

2.6 SSBP1 mRNA 與Ki67 mRNA 在 肺 腺 癌 組 織中的相關(guān)性 Ki67為細(xì)胞增殖的標(biāo)志物。為了進(jìn)一步研究SSBP1對肺腺癌細(xì)胞增殖的影響,我們通過TCGA 數(shù)據(jù)庫分析肺腺癌組織中SSBP1 mRNA 與Ki67 mRNA 的相關(guān)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSBP1 mRNA 的表達(dá)水平與Ki67 mRNA 的表達(dá)水平呈正相關(guān)性(r=0.39,P<0.01),見圖6。

3 討論

線粒體是真核生物體內(nèi)重要的細(xì)胞器,處于能量轉(zhuǎn)換和新陳代謝的中心位置,在生命活動中發(fā)揮重要作用。近年來,線粒體功能異常與腫瘤的關(guān)系受到越來越多的關(guān)系。目前人類基因組中發(fā)現(xiàn)3種單鏈DNA 結(jié)合蛋白(SSB1、SSB2和SSBP1),其中人SSBP1基因特性定位于線粒體,其結(jié)構(gòu)高度保守,包括4個外顯子和3個內(nèi)含子。SSBP1是線粒體DNA 合成的關(guān)鍵分子,主要參與線粒體DNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、損傷后修復(fù)過程。SSBP1表達(dá)異常將直接導(dǎo)致線粒體DNA 拷貝數(shù)異常或基因突變,最終造成惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

圖3 SSBP1 mRNA 表達(dá)量與肺癌患者總生存率和無病生存率的關(guān)系 A：SSBP1 mRNA 表達(dá)量與肺腺癌患者總生存率的關(guān)系;B：SSBP1 mRNA 表達(dá)量與肺鱗癌患者總生存率的關(guān)系;C：SSBP1 mRNA 表達(dá)量與肺腺癌患者無病生存率的關(guān)系;D：SSBP1 mRNA 表達(dá)量與肺鱗癌患者無病生存率的關(guān)系

圖4 陰性對照組與SSBP1敲低組A549的增殖情況比較 A：2組SSBP1 mRNA 相對表達(dá)量的比較;B：2組細(xì)胞增殖情況比較;C：2組細(xì)胞克隆形成能力的比較 吉姆薩染色 ×200

SSBP1的表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究表明,SSBP1 在結(jié)腸癌中表達(dá)增加,敲低SSBP1 的表達(dá)影響線粒體質(zhì)量誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。針對胃癌SSBP1單核苷酸多態(tài)性的研究結(jié)果表明,SSBP1-rs6976500是一個獨(dú)立的預(yù)后標(biāo)志物,可改善目前胃癌TNM 分期系統(tǒng)的預(yù)后預(yù)測[5]。在胃癌中SSBP1 的表達(dá)增高,與TNM 分期和腫瘤浸潤密切相關(guān)[9]。有報道炎癥因子IL-6可上調(diào)SSBP1的表達(dá),增加的SSBP1可促進(jìn)線粒體的生物合成,誘導(dǎo)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá),促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[8]。在肝癌中SSBP1的表達(dá)與腫瘤數(shù)量、腫瘤大小、門靜脈癌栓和腫瘤分級具有顯著的相關(guān)性,SSBP1高表達(dá)患者預(yù)后較差[10]。但SSBP1在三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移的組織中表達(dá)降低,且通過TGFβ-SMAD 通路抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移[5]。Wang等[11]研究顯示,敲低SSBP1的表達(dá)能增強(qiáng)肺癌H1299細(xì)胞的放射敏感性,誘導(dǎo)肺癌H1299細(xì)胞阻滯于G2/M 期。這些結(jié)果說明SSBP1在不同的腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用。本研究中,我們通過TCGA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)SSBP1 mRNA 在肺腺癌組織中表達(dá)明顯增高,而且SSBP1 mRNA 的表達(dá)水平與患者的臨床分期和預(yù)后不良密切相關(guān),高表達(dá)SSBP1 mRNA 的肺腺癌患者的總體生存率和無病生存率顯著降低,提示SSBP1可能作為判斷肺腺癌患者預(yù)后的新型分子標(biāo)志物。

圖5 陰性對照組與SSBP1敲低組Akt磷酸化水平比較

為了證明SSBP1 在肺腺癌中的生物學(xué)功能,我們通過慢病毒構(gòu)建了穩(wěn)定SSBP1敲低的A549細(xì)胞,結(jié)果顯示敲低SSBP1能抑制A549細(xì)胞的增殖和克隆形成。Akt信號通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),該通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移等,Akt是多種腫瘤的治療靶點(diǎn)[12-13]。本研究結(jié)果顯示,敲低SSBP1的表達(dá)降低A549細(xì)胞Akt的磷酸化水平,提示SSBP1可能通過Akt通路促進(jìn)A549細(xì)胞增殖。我們也發(fā)現(xiàn)SSBP1的表達(dá)水平與作為細(xì)胞增殖標(biāo)志物的Ki67的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)性。p21和p53 是Akt信號通路重要的靶蛋白。有研究顯示,SSBP1 能與p21 在肝癌細(xì)胞中相互作用,阻止p21免受泛素化的降解,影響細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換[14]。SSBP1 也可與p53 相互作用,保護(hù)p53 免受泛素-蛋白酶體通路的降解,敲低SSBP1的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期G2/M 期阻滯依賴于p53或p300[15]。最近的研究顯示,SSBP1 在結(jié)腸癌中表達(dá)增高,SSBP1可通過Akt/mTOR 通路有利于結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[8]。這些結(jié)果提示,SSBP1可能通過調(diào)控Akt進(jìn)而影響p21、p53 或mTOR的表達(dá)影響肺腺癌細(xì)胞增殖,SSBP1 可能是肺腺癌治療的重要分子靶標(biāo)。

圖6 SSBP1與Ki67在肺腺癌組織中表達(dá)相關(guān)性

綜上所述,SSBP1 mRNA 在肺腺癌組織中表達(dá)增高,SSBP1 mRNA 的表達(dá)水平與肺腺癌患者分期和預(yù)后密切相關(guān),高表達(dá)SSBP1 mRNA 的患者預(yù)后較差。敲低SSBP1的表達(dá)抑制肺腺癌細(xì)胞增殖和Akt的磷酸化水平。因此,SSBP1 是肺腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突