向群 殷宗寶

1中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科570208;2中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院急診科570208

近年ARDS的治療有保護(hù)性通氣、液體管理、體外膜肺氧合等,患者病死率有一定的下降,但是中度及以上的ARDS患者的病死率仍高于40%[1]。這是因?yàn)锳RDS 的臨床表現(xiàn)缺乏特異性,與心源性肺水腫和重癥肺炎等疾病極不容易相鑒別,早期診斷、早期干預(yù)對改善預(yù)后,降低病死率有十分重要的作用。ARDS的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜,涉及到全身炎癥反應(yīng)、凝血/纖溶平衡失調(diào)、肺泡上皮細(xì)胞及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等病理生理過程,在全身炎癥反應(yīng)與肺泡上皮細(xì)胞及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的過程中,機(jī)體全身炎癥反應(yīng)中的抗炎和促炎反應(yīng)失衡起著主要作用,因此如果臨床上有早期監(jiān)測機(jī)體炎癥變化和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的指標(biāo)則可以提高診斷率和預(yù)后[2-3]。目前研究發(fā)現(xiàn)IL-18是炎癥反應(yīng)一個高度蓋然性的指標(biāo)[4],而內(nèi)皮細(xì)胞特異分子1 (endothelial cell specific molecule-1,ESM-1)可以反映肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的潛在指標(biāo)[5]。本研究旨在探討血清IL-18 和ESM-1 在ARDS大鼠的診斷價值,為臨床早期診斷ARDS提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 光學(xué)顯微鏡：日本Oly mpus公司,酶標(biāo)儀：奧地利TECAN 公司,臺式普通離心機(jī)：上海安亨科學(xué)儀器廠,醫(yī)用深低溫冰箱：德國For ma公司,超凈工作臺：北京偉達(dá)凈化技術(shù)研究所,Finnpipette 可調(diào)式移液器：熱電(上海)儀器有限公司,脂多糖內(nèi)毒素：日本化藥株式會社,進(jìn)口許可證號X20000349;大鼠IL-18和ESM-1 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒：美國Rapid Bio公司。濃縮型兔抗大鼠IL-18和ESM-1抗體(美國Santa Cruz公司),即用型SABC 試劑盒(兔Ig G)和DAB 顯色試劑盒 (棕黃色,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 動物來源及分組 健康清潔級雄性大鼠120只(5 周),合格證號：SCXK0020158,體質(zhì)量(150±20)g,由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供;完全數(shù)字隨機(jī)分為對照組40 只、干預(yù)組40 只、ARDS組40只,常規(guī)喂養(yǎng)。

1.3 造模方法 ARDS組：參照王華兵等[6]建立ARDS模型方法,取Wistar大鼠,以2%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔內(nèi)注射麻醉后,用鼠灌胃器插入氣道并回抽出有大量氣體后證明確己在氣管內(nèi),緩慢注入含脂多糖內(nèi)毒素的生理鹽水2 mg/kg (濃度2 g/L),注入后立即旋轉(zhuǎn)動物,使藥液在肺內(nèi)分布均勻。干預(yù)組：同ARDS組以等量的生理鹽水代替脂多糖內(nèi)毒素氣管內(nèi)注入。

1.4 大鼠血清標(biāo)本采集 在ARDS模型成功后6、12、24、48 h,分別用2%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉,仰臥位開腹腔,取腹主動脈近心端斷端全血8 ml,室溫靜置2 h 后,以3 000 r/min 離心15 min,離心半徑10.0 c m,取上層血清保存于-70 ℃冰箱中備用。將右下肺于4%多聚甲醛固定,待病理組織學(xué)觀察,左下肺于-80 ℃液氮內(nèi)保存待實(shí)時熒光PCR 法檢測。干預(yù)組和正常對照組用同樣的方法收集標(biāo)本。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 普通病理觀察 右肺下葉肺組織常規(guī)HE染色。

1.5.2 左肺下葉肺組織IL-18 mRNA、ESM-1B mRNA 檢測 取液氮內(nèi)各組大鼠左下肺組織,用Trizol試劑提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照試劑盒說明書操作。采用引物設(shè)計軟件：Pri mer 5.0 Rotor-gene 6.0,Cor bett Research生產(chǎn)。Ppia：正向引物 5'-CCGCAGAAAGGATATGGCTA-3',反向引物5'-GGCAGGAGCTCTATGCATCA-3',長度160 bp;IL-18：正向引物5'-CACCTATCGCAGTCCACTTGAC-3',反向引物5'GCACCGCTACATCATTCGA3',長度133 bp;ESM-1：正向引物5'-AGCTATAACATGCTCGCGAGTC-3',反向引物5'-CCTAGATTCGGTCGCTTAGAT-3',長度95 bp。目的基因和管家基因PCR反應(yīng)體系：d NTP (每次2.5 mmol/L)2.5 μl,10×PCR 緩沖液2μl,Mg Cl2溶液1.5μl,Taq聚合酶2.5μmol/L,10μmol/L PCR 正向引物和反向引物各1μl,c DNA 1μl,加水至總體積25μl;PCR 反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min;45個PCR 循環(huán)(94 ℃25 s,59 ℃30 s,72 ℃20 s);72 ℃延 伸5 min。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行10 倍梯度稀釋：設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1,分別稀釋為1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9。幾個梯度稀釋的DNA 模板和所有c DNA 樣品分別配置Realti me PCR 反應(yīng)體系。置Realti me PCR 儀 進(jìn) 行PCR 反 應(yīng),Ppia (ENF)：95 ℃5 min,43個PCR 循 環(huán) [95 ℃15 s,60 ℃10 s,70 ℃20 s,80 ℃ (收集熒光)5 s]。Ppia(BSR)：95 ℃5 min,35 個PCR 循 環(huán) [95 ℃10 s,59 ℃15 s,72 ℃20 s,80.5 ℃ (收 集 熒光)5 s]。IL-8：95 ℃5 min,40 個PCR 循 環(huán)[95 ℃10 s,59 ℃15 s,72℃20 s,83℃(收集熒光)5 s]。ESM-1：95 ℃5 min,43個PCR 循環(huán)[95 ℃10 s,59 ℃15 s,72 ℃20 s。78 ℃(收集熒光)5 s]。結(jié)束后從72 ℃緩慢加熱到99 ℃建立PCR 產(chǎn)物熔解曲線,根據(jù)此曲線,各樣品目的基因和管家基因濃度由機(jī)器生成。每個樣品目的基因濃度除以其管家基因濃度,即為此樣品此基因校正后的相對含量。

1.5.3 大鼠血清IL-18和ESM-1的測定 采用雙抗體夾心法測定大鼠血清IL-18和ESM-1,按試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.5.4 免疫組織化學(xué) 肺組織IL-18和核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的測定按免疫組織化學(xué)試劑盒說明的SABC 法進(jìn)行。據(jù)肺組織的IL-18和NF-κB IHC 表 達(dá) 結(jié) 果 用SPOT 及IPP 圖像采集分析系統(tǒng)處理,40×10視野下觀察采集圖像,I mage-Pro Pl us 6.0版專業(yè)圖像分析軟件處理結(jié)果,以累積吸光度值表示IL-18 和NF-κB 表達(dá)的相對強(qiáng)度,每張切片選5個免疫反應(yīng)較強(qiáng)視野進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示,多組比較采用方差分析,2 組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理變化 干預(yù)組未出現(xiàn)明顯的病理變化。ARDS組12 h表現(xiàn)為肺泡間質(zhì)增厚,肺泡水腫;24 h表現(xiàn)為肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張,有炎癥細(xì)胞滲出,肺泡結(jié)構(gòu)大量破壞。見圖1。

2.2 各組左肺下葉肺組織IL-18 mRNA、ESM-1 mRNA 的表達(dá) ARDS 組各時間點(diǎn)IL-18 mRNA和ESM-1 mRNA 表達(dá)水平均高于干預(yù)組 (P值均<0.05)。隨著時間的延長,ARDS 組IL-18 mRNA 和ESM-1 mRNA 的表達(dá)逐漸增加;ARDS組6 h 的IL-18 mRNA 和ESM-1 mRNA 表 達(dá) 與48 h的比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=5.12、5.17,P值均<0.05)。見表1。

2.3 各組大鼠肺組織IL-18和NF-κB的表達(dá) 與干預(yù)組相比,ARDS 組各時間點(diǎn)IL-18 和NF-κB陽性反應(yīng)增強(qiáng)(P值均<0.05),呈片塊狀或粗條索狀(表2、圖2)。

2.4 各組大鼠血清IL-18 和ESM-1 的含量 ARDS組各時間點(diǎn)大鼠血清IL-18 和ESM-1 的含量均高于干預(yù)組 (P值均<0.05)。ARDS組6 h血清IL-18和ESM-1含量與48 h比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=5.46、5.14,P值均<0.05)。見表3。

圖1 干預(yù)組及ARDS組肺組織病理 HE ×100 A：干預(yù)組;B：ARDS組12 h;C：ARDS組24 h

表1 各組大鼠肺組織不同時間點(diǎn)IL-18 mRNA 和ESM-1 mRNA 的表達(dá) (×10 2,±s)

表1 各組大鼠肺組織不同時間點(diǎn)IL-18 mRNA 和ESM-1 mRNA 的表達(dá) (×10 2,±s)

注：ESM-1為內(nèi)皮細(xì)胞特異分子1;與干預(yù)組比較,a P <0.01;與6 h比較,b P <0.05

組別 例數(shù) IL-18 mRNA ESM-1 mRNA 6 h 12 h 24 h 48 h 6 h 12 h 24 h 48 h對照組 40 0.48±0.06 0.48±0.04 0.47±0.05 0.47±0.06 0.62±0.07 0.62±0.08 0.61±0.07 0.62±0.05干預(yù)組 40 0.70±0.04 0.68±0.03 0.68±0.04 0.69±0.08 0.91±0.05 0.93±0.06 0.94±0.01 0.94±0.03 ARDS組 40 2.12±1.07 a 4.38±0.87 a 4.71±0.54 a 5.17±0.94 ab 2.23±0.88 a 4.63±0.67 a 4.92±0.45 a 5.57±0.62 ab F 值 4.12 4.56 4.87 5.01 4.14 4.77 4.92 5.21 P 值 0.03 0.03 0.01 0.01 0.03 0.01 0.01 0.01

表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)肺間質(zhì)IL-18和NF-κB的定量表達(dá) (±s)

表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)肺間質(zhì)IL-18和NF-κB的定量表達(dá) (±s)

注：NF-κB為核因子κB;與干擾組比較,a P <0.01

組別 例數(shù) IL-18 NF-κB 6 h 12 h 24 h 48 h 6 h 12 h 24 h 48 h對照組 40 1.47±0.86 1.39±0.92 1.27±0.64 1.21±0.57 1.35±0.76 1.03±0.47 1.10±0.31 1.05±0.43干預(yù)組 40 1.55±0.82 1.54±0.58 1.53±0.88 1.53±0.62 1.65±0.34 1.77±0.54 1.75±0.28 1.76±0.14a ARDS組 40 11.57±1.81 a 12.71±1.43 a 13.22±1.12 a 13.41±1.33 a 10.67±0.90 a 11.73±1.01 a 12.11±1.23 a 12.85±1.17 a F 值 6.21 7.23 9.56 9.57 6.03 6.05 6.42 6.45 P 值 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

圖2 ARDS組大鼠肺組織各時間點(diǎn)IL-18的表達(dá) DAB ×400 A：6 h;B：12 h;C：24 h;D：48 h

表3 各組大鼠血清不同時間點(diǎn)IL-18和ESM-1含量 (ng/L,±s)

表3 各組大鼠血清不同時間點(diǎn)IL-18和ESM-1含量 (ng/L,±s)

注：ESM-1為內(nèi)皮細(xì)胞特異分子1;與干預(yù)組比較,a P <0.01;與6 h比較,b P <0.05

組別 例數(shù) IL-18 ESM-1 6 h 12 h 24 h 48 h 6 h 12 h 24 h 48 h對照組 40 0.71±0.06 0.83±0.03 0.77±0.08 0.64±0.04 0.48±0.04 0.37±0.06 0.21±0.02 0.19±0.05干預(yù)組 40 0.97±0.02 0.99±0.04 0.98±0.06 0.99±0.06 0.88±0.01 0.86±0.07 0.98±0.06 0.87±0.04 ARDS組 40 9.05±0.51 a 11.07±0.97 a 12.33±0.49 a 14.58±0.82 ab 10.23±0.14 a 13.01±0.31 a 14.87±0.24 a 15.78±0.41 ab F 值 7.21 7.79 8.01 8.99 8.23 9.76 10.23 11.33 P 值 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

3 討論

患者在嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等疾病過程中容易發(fā)生ARDS,其臨床特征是由于肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞損傷引起的彌漫性肺間質(zhì)水腫和肺泡水腫,以進(jìn)行性低氧血癥、呼吸窘迫為特征的臨床綜合征[7]。各種損傷導(dǎo)致機(jī)體抗炎和促炎反應(yīng)失衡引起肺泡上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞彌漫性損傷是ARDS發(fā)生的病理基礎(chǔ)[2]。盡管目前在治療上取得了很多進(jìn)展,但ARDS 發(fā)病率和病死率仍居高不下。其原因之一就是臨床上缺乏敏感的ARDS早期診斷和病情嚴(yán)重程度監(jiān)測指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)用大鼠ARDS模型探討不同時間點(diǎn)的肺結(jié)構(gòu)變化和血清炎癥因子的變化,闡明他們之間的關(guān)系。病理切片實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示干預(yù)組肺泡結(jié)構(gòu)基本正常,未出現(xiàn)明顯病理變化;ARDS組12 h大鼠肺間質(zhì)水腫、增厚,24 h 時肺泡結(jié)構(gòu)破壞,符合ARDS組織病理演變過程。

IL-18是近年發(fā)現(xiàn)的一種多功能細(xì)胞因子,它誘導(dǎo)干擾素-γ生成,促進(jìn)T 細(xì)胞活化,趨化多形核白細(xì)胞到達(dá)急性炎癥部位,同時激活的IL-18與IL-18受體a鏈結(jié)合后,再與IL-18受體β鏈結(jié)合,形成三者復(fù)合體,通過NF-κB 信號途徑發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)作用[4]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過抑制NF-κB 信號途徑可以減輕IL-18細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平,導(dǎo)致減輕ARDS大鼠炎癥癥狀[8-10]。有學(xué)者研究作用發(fā)現(xiàn),胱甘草定可以通過抑制NF-κB 從而減少大鼠血漿IL-18的含量來保護(hù)脂多糖致ARDS大鼠[4]。這些研究證明了NF-κB 可以促進(jìn)IL-18 的生成,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)ARDS 組的6、12、24、48 h免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,隨著時間的延長,IL-18和NF-κB逐漸在肺組織高表達(dá),與各組相應(yīng)時間點(diǎn)上的干預(yù)組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值 均<0.05)。這 說 明IL-18 和NF-κB 在ARDS發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用,尤其是在引起肺結(jié)構(gòu)性破壞并促使肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞滲出大量造成肺間質(zhì)水腫、肺泡壁透明膜形成起著關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)ARDS組大鼠肺組織和血液中的IL-18含量也表現(xiàn)為隨著時間的延長逐漸增高,且ARDS組48 h的血清IL-18含量和肺組織的表達(dá)與6 h的相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05),表明IL-18可能是反映和預(yù)測炎癥嚴(yán)重情況指標(biāo)之一。在炎癥感染和機(jī)械通氣大鼠的肺泡灌洗液、血清發(fā)現(xiàn)了IL-18,氣管內(nèi)滴入IL-18可以增加肺血管滲透性而滴入IL-18抗體可以緩解血管滲透性,減輕肺損傷[11-12]。在內(nèi)毒素血癥誘導(dǎo)的ARDS 小鼠模型中IL-18 mRNA 高表達(dá)[13]。本實(shí)驗(yàn)ARDS組大鼠肺組織IL-18 mRNA 在6 h高表達(dá),且隨著時間的延長表達(dá)增高,ARDS組48 h IL-18 mRNA 與6 h比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05),說明IL-18是肺組織炎癥重要指標(biāo),可以用于后期監(jiān)測。IL-18是一種重要的炎癥趨化因子,在ARDS早期血漿中IL-18濃度升高與ARDS患者病死率、多器官功能衰竭發(fā)生相關(guān)[14]。雖然炎癥因子與ARDS患者預(yù)后相關(guān),感染、應(yīng)激等可以引起炎癥因子升高,不具有特異性,但是將IL-18和其他類型生物標(biāo)志物聯(lián)用,可用于ARDS 診斷和預(yù)后評估。本實(shí)驗(yàn)從ARDS 大鼠肺組織和血清含量方面上說明IL-18是一個很有潛力的評價炎癥嚴(yán)重程度指標(biāo)。

ESM-1大部分由激活的內(nèi)皮細(xì)胞分泌,主要在肺表達(dá),其次在腎血管、腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞等。在肺組織中,ESM-1大量表達(dá)在肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞,在肺泡上皮細(xì)胞少量表達(dá),而肺大血管內(nèi)皮細(xì)胞未見表達(dá)[15]。多種炎癥細(xì)胞因子可以促進(jìn)ESM-1 mRNA 表達(dá)。研究表明脂多糖、腫瘤壞死因子α、IL-1等可以促進(jìn)肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌ESM-1,與時間成正比[17]。本實(shí)驗(yàn)ARDS 組 的6、12、24、48 h 大 鼠 肺 組 織 中 的IL-18 mRNA、ESM-1 mRNA 表達(dá)和血清IL-18、ESM-1水平逐漸增高,且以上指標(biāo)在6 h和48 h比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05),這表明隨著炎癥程度的加重,肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的ESM-1 mRNA 和IL-18 mRNA 表達(dá)逐漸增高,說明IL-18有可能促進(jìn)了肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞對ESM-1的表達(dá)和分泌,加重了ARDS嚴(yán)重程度。有研究發(fā)現(xiàn)血漿ESM-1 水平越高,提示ARDS 的預(yù)后越差,認(rèn)為ESM-1可以作為獨(dú)立預(yù)測ARDS患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)[15]。這也與本實(shí)驗(yàn)在不同時間點(diǎn)ARDS大鼠肺組織的病理結(jié)構(gòu)和血清學(xué)檢測結(jié)果相一致。

總之,炎癥因子IL-18是ARDS早期的監(jiān)測指標(biāo)之一,增加了肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透性。隨著ARDS的進(jìn)展,IL-18和ESM-1的表達(dá)和水平也增加,提示其預(yù)后較差,為臨床ARDS的診斷和預(yù)后評估提供了理論支持。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突