程 飛，陳景福，李詩(shī)成，劉 靜，陳麗珍，郭灼林

糖尿病作為一種全身慢性多發(fā)性疾病，隨著病情的加重，病人會(huì)出現(xiàn)多種慢性并發(fā)癥，其中糖尿病血管病變、糖尿病性腎病和糖尿病視網(wǎng)膜病變是常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥，對(duì)病人的預(yù)后和生活質(zhì)量產(chǎn)生巨大的影響。糖尿病血管病變是心血管疾病發(fā)生的誘導(dǎo)因素，有相關(guān)研究指出血管內(nèi)皮細(xì)胞在糖尿病血管病變過(guò)程中起著重要作用。有研究表明，高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)出現(xiàn)損傷，伴隨細(xì)胞凋亡與糖尿病足和糖尿病視網(wǎng)膜病變密切相關(guān)[1]。黃芪作為一種傳統(tǒng)的中藥材，具有利水消腫、固表補(bǔ)氣的作用，同時(shí)黃芪中包含豐富的有效單體成分，如黃酮類、皂苷類和多糖類，其中黃芪甲苷在功效方面已有較多研究，研究顯示，黃芪對(duì)腎病病人尿蛋白有很好的改善作用，從而發(fā)揮保護(hù)腎功能的作用[2]。另外，黃芪甲苷具有改善腦缺血、心肌缺血和抗氧化的作用，同時(shí)還對(duì)糖尿病腎病等多種疾病具有改善作用。黃芪甲苷具有抗炎、減少氧化物產(chǎn)生、對(duì)抗細(xì)胞凋亡的作用[3-4]。ClC-3氯離子通道作為影響細(xì)胞容積和細(xì)胞電位的通道，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等有直接的作用[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)探討ClC-3氯離子通道在高糖誘導(dǎo)HUVECs損傷中的分子作用以及黃芪甲苷的對(duì)抗作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 細(xì)胞培養(yǎng)箱為HERA Cell 150，胎牛血清和低糖DMEM均購(gòu)自BI公司；二甲基亞砜、MTT試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒、一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒、Caspase-3檢測(cè)試劑盒、Annexin-Ⅴ凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；HUVECs株來(lái)源于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所；黃芪甲苷購(gòu)自中國(guó)藥品生物制定鑒定所，其純度高于97%。

1.2 方法

1.2.1 分組及干預(yù)方法 首先構(gòu)建高糖誘導(dǎo)HUVECs損傷模型，采用含有10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，分為空白對(duì)照組、高糖組、黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷中劑量組和黃芪甲苷高劑量組，其中高糖組、黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷中劑量組和黃芪甲苷高劑量組均采用33mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)細(xì)胞[6]，黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷中劑量組和黃芪甲苷高劑量組分別給予黃芪甲苷10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L[7]。黃芪甲苷低劑量組、黃芪甲苷中劑量組和黃芪甲苷高劑量組先將HUEVCs預(yù)培養(yǎng)18 h后再在高糖環(huán)境下培養(yǎng)48 h。

1.2.2 MTT細(xì)胞活性檢測(cè) 采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，先將細(xì)胞鋪板接種于96孔板中，然后按照藥物和葡萄糖處理方式將細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后棄掉培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液20 μL與細(xì)胞培養(yǎng)基180 μL混合后孵育4 h，將上清液棄掉后加入二甲基亞砜，搖床振蕩10 min后采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)其吸光度值，波長(zhǎng)為490 nm。

1.2.3 細(xì)胞裂解和相應(yīng)檢測(cè)樣本處理 將HUEVCs接種于六孔板中，讓細(xì)胞密度保持在每孔1×105個(gè)，然后培養(yǎng)24 h后進(jìn)行藥物處理和造模，在處理完成后收集細(xì)胞上清液，測(cè)定細(xì)胞釋放的LDH和NO。然后收集細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)因子，采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3次后，采用細(xì)胞RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)將細(xì)胞從孔板上提取下來(lái)后，在12 000 g下離心15 min后將細(xì)胞碎片去除，應(yīng)用蛋白定量方法(BCA)對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 LDH測(cè)定 采用LDH試劑盒檢測(cè)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同組處理后收集細(xì)胞上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作后在酶標(biāo)儀下進(jìn)行440 nm波長(zhǎng)下的吸光度測(cè)定，并計(jì)算LDH濃度。

1.2.5 NO和eNOS活力測(cè)定 NO采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定，對(duì)細(xì)胞分組處理后收集細(xì)胞上清液，按照說(shuō)明書(shū)操作在酶標(biāo)儀550 nm下進(jìn)行吸光度測(cè)定。eNOS則應(yīng)用ELISA試劑盒進(jìn)行測(cè)定，收集細(xì)胞樣本并按照說(shuō)明書(shū)操作，在酶標(biāo)儀下進(jìn)行450 nm的吸光度測(cè)定。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 結(jié)合Caspase-3蛋白表達(dá)量對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，采用細(xì)胞裂解法收集細(xì)胞裂解液，并且按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，在405 nm下進(jìn)行吸光度測(cè)定。

1.2.7 細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度檢測(cè) 采用氯離子熒光探針(MQAE)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度，采用HEPES緩沖液將MQAE濃度調(diào)節(jié)至10 mmol/L，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成MQAE后細(xì)胞正常孵育1 h，然后將其放置于熒光顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)，并應(yīng)用軟件分析平均熒光強(qiáng)度。

1.2.8 細(xì)胞內(nèi)ClC-3氯離子通道的mRNA和蛋白水平檢測(cè) 不同組樣本處理后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行蛋白裂解后提取，結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-page)電泳分離，采用抗體孵育后檢測(cè)ClC-3氯離子通道的蛋白表達(dá)量，抗體購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，一抗?jié)舛葹?∶200[8]。mRNA檢測(cè)采用TRIZOL法提取總RNA后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增檢測(cè)相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)中ClC-3氯離子通道的上游引物為5′-ATGACAAATGGAGGCAGCAT-3′，下游引物為5′-TTTCCCAAGTAACCTCTGATGC-3′，內(nèi)參ACTIN引物上游引物為5′-GCCAACCGTGAGAAGATGAC-3′，下游引物為5′-GTGGTGGTGAAGCTGTAGC-3′。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪甲苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVECs活力的影響 高糖成功誘導(dǎo)HUVECs損傷模型，MTT和細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示高糖成功導(dǎo)致細(xì)胞損傷，細(xì)胞活力在高糖處理后其活性下降至70.31%，不同濃度黃芪甲苷能夠增加細(xì)胞活力，降低細(xì)胞損傷。詳見(jiàn)表1。

表1 各組HUVECs活力比較(±s)單位：%

2.2 黃芪甲苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVECs相關(guān)指標(biāo)的影響 高糖環(huán)境處理HUVECs后，細(xì)胞分泌的NO明顯減少，LDH明顯增加，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)eNOS明顯減少，Caspase-3明顯增加，而黃芪甲苷處理細(xì)胞后，NO、eNOS較高糖組明顯增加，LDH、Caspase-3較高糖組明顯降低，這與HUVECs活力提高結(jié)果相一致。詳見(jiàn)表2。

表2 各組HUVECs相關(guān)指標(biāo)比較(±s)

2.3 黃芪甲苷處理高糖環(huán)境的HUVECs后細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度 對(duì)損傷細(xì)胞應(yīng)用黃芪甲苷后細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞損傷后細(xì)胞內(nèi)氯離子有明顯降低，同時(shí)黃芪甲苷能夠抑制細(xì)胞損傷導(dǎo)致的氯離子外流。詳見(jiàn)圖1。

2.4 ClC-3氯離子通道情況 對(duì)各組ClC-3氯離子通道蛋白和mRNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境下，ClC-3氯離子通道蛋白和mRNA水平明顯降低，而不同濃度黃芪甲苷組mRNA和蛋白水平較高糖組有所增加。詳見(jiàn)圖2。

與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與高糖組比較，△ P<0.05，# P<0.01。圖1 各組細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度相對(duì)表達(dá)量比較

與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與高糖組比較，△ P<0.05，# P<0.01。圖2 各組ClC-3氯離子通道蛋白和mRNA水平比較

3 討 論

高血糖是糖尿病血管性病變的重要并發(fā)癥，高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致發(fā)病，且多項(xiàng)研究表明，高糖環(huán)境會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加。本研究結(jié)果顯示，高糖處理后其細(xì)胞活力降低，凋亡細(xì)胞增多。目前，糖尿病血管性病變的臨床治療方式有采用具有抗細(xì)胞凋亡的藥物，本研究結(jié)果顯示，黃芪甲苷預(yù)處理能夠有效抑制高糖導(dǎo)致的細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡。同時(shí)在細(xì)胞損傷后產(chǎn)生的LDH均明顯增加，而應(yīng)用黃芪甲苷后相應(yīng)指標(biāo)的釋放量都減少，表明對(duì)細(xì)胞損傷起著保護(hù)作用。對(duì)細(xì)胞凋亡因子Caspase-3進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在高糖誘導(dǎo)下凋亡細(xì)胞增多，而應(yīng)用黃芪甲苷處理后，Caspase-3降低。

在高糖環(huán)境下，細(xì)胞多種活力因子和炎性因子發(fā)生明顯改變，同時(shí)伴隨多種機(jī)制和信號(hào)通路的改變[9]。已有研究顯示，高糖環(huán)境下，伴隨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、酸堿平衡的紊亂，在細(xì)胞受到損傷過(guò)程中，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，電生理數(shù)據(jù)改變[10-11]，鉀、氯離子通道負(fù)載的離子出現(xiàn)外流現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，對(duì)高糖處理后細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度明顯降低，表明氯離子流失，而應(yīng)用黃芪甲苷后，氯離子流失減輕，表明黃芪甲苷可能通過(guò)氯離子通道減少氯離子流失[12]，減少HUVECs凋亡。

綜上所述，黃芪甲苷能夠通過(guò)ClC-3氯離子通道降低高糖誘導(dǎo)的HUVECs損傷；高糖誘導(dǎo)的HUVECs損傷過(guò)程中有胞內(nèi)氯離子的外流，而黃芪甲苷能夠增加ClC-3氯離子通道的表達(dá)，并增加胞內(nèi)氯離子濃度，黃芪甲苷通過(guò)ClC-3氯離子通道降低高糖誘導(dǎo)的HUVECs損傷，揭示黃芪甲苷降低高糖誘導(dǎo)HUVECs損傷的分子機(jī)制。