劉艷艷，劉孝龍，趙萌，范新炯，3

（1. 安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽合肥230032；2. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽合肥230026；3. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510275）

鄰苯二甲酸酯（phthalates esters，PAEs）是塑料工業(yè)生產(chǎn)中的一種增塑劑和軟化劑，用來(lái)提高塑料的彈性和柔韌性，因此被廣泛應(yīng)用于工業(yè)塑料產(chǎn)品和消費(fèi)品中，如農(nóng)藥、潤(rùn)滑劑、橡膠、建筑材料、醫(yī)療器材、化妝品、餐具、兒童玩具等，其在塑料制品中的添加量高達(dá)20%～50%［1-2］。全球每年P(guān)AEs的使用量約1.8 億t，而且這一數(shù)據(jù)可能會(huì)持續(xù)增長(zhǎng)［3-5］。在塑料中，PAEs與塑料基質(zhì)以非共價(jià)的形式結(jié)合，因此在塑料產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用和廢棄處理過(guò)程中，PAEs 很容易從塑料產(chǎn)品中釋放出來(lái)進(jìn)入環(huán)境［6］。PAEs 在我國(guó)水資源和土壤環(huán)境中檢出率較高，長(zhǎng)江、黃河和松花江等河流的多處水域受到PAEs 的污染，其濃度超出國(guó)家規(guī)定的飲用水標(biāo)準(zhǔn)限值［7］。大量研究表明，PAEs 的殘留直接影響動(dòng)植物的生長(zhǎng)，同時(shí)在動(dòng)植物體內(nèi)蓄積，通過(guò)食物鏈轉(zhuǎn)移到人體，危害人類的健康［5］。PAEs 作為一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，還可以通過(guò)消化、呼吸系統(tǒng)和皮膚等多種途徑進(jìn)入人體，在人體內(nèi)蓄積，并對(duì)人體造成傷害［8］。多項(xiàng)研究表明，長(zhǎng)期接觸PAEs 可誘導(dǎo)胎兒死亡、癌癥發(fā)生、肝臟功能和腎臟功能損傷［9］。也能夠?qū)е滦坌陨扯拘?，主要體現(xiàn)為促黃體生成素（LH）、睪酮、卵泡刺激素（FSH）等激素水平的改變，精子質(zhì)量降低，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致睪丸癌［10-11］。產(chǎn)前接觸PAEs 會(huì)影響母體甲狀腺激素和性激素的分泌，同時(shí)其可能導(dǎo)致妊娠期高血壓子癇及妊娠期糖尿病等疾病的發(fā)生、發(fā)展［12-15］。所以，有必要尋找消除PAEs污染物的有效途徑。

生物降解是去除環(huán)境中PAEs 的主要途徑，具有高效、低成本和環(huán)境安全等特點(diǎn)［16］。生物降解途徑是通過(guò)酯酶逐步脫酯化反應(yīng)，先生成相應(yīng)的鄰苯二甲酸單酯，然后生成鄰苯二甲酸［17］。近些年通過(guò)基因組文庫(kù)法、基因組或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及注釋分析等方法克隆出了水解PAEs 的酯酶，但是數(shù)量并不多。來(lái)源于芽孢桿菌HJ14的酯酶EstZ1對(duì)鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）有降解作用［18］；Sulfobacillus acidophilus DSM10332 中的PAEs 酯酶EstS1、來(lái)源于廢水生物膜的宏基因組文庫(kù)的酯酶DphB 以及克隆于Camelimonas sp. M11 的酯酶均不能水解毒性更大的鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）［19-21］；來(lái)源于Picrophilus torridus 的PAEs 酯酶EstPt1 和Acinetobacter sp. LMB-5 的酯酶Est_3563 對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）有降解作用［22-23］；從土壤宏基因組文庫(kù)中克隆FAEs 酶BDS4 能水解DMP、DEP、DBP，對(duì)鄰苯二甲酸二丙酯（DPrP）以及其它中長(zhǎng)側(cè)鏈的PAEs 無(wú)降解作用［24］；從Bacillus velezensis SYBC H47 中克隆的酯酶BaCEs04 能夠水解DMP、DEP、DPrP、DBP，但是不能降解鄰苯二甲酸二戊酯（DPP）、鄰苯二甲酸二己酯（DnHP）［25］。上述酯酶能夠水解鄰苯二甲酸二烷基酯生成相應(yīng)的單酯，但大多數(shù)酶對(duì)PAEs的降解譜較窄。來(lái)源于Acinetobacter sp. M673 的酯酶能夠水解DMP、DEP、DPrP、DBP、DPP、DnHP 等多種PAEs 為相應(yīng)的單酯，底物譜較廣，最適pH 為7.5，但在堿性pH 中耐受性較差［26］。現(xiàn)階段所篩選到的酯酶最適pH 多在7.5 ～8.0范圍內(nèi)，雖然酯酶EstZ1和酯酶EstPt1 最適pH 超過(guò)8.0，但是只能降解一種PAEs［18，23］。因此，篩選具有廣譜PAEs 降解活性和良好環(huán)境適應(yīng)性的酯酶具有重要意義。

本研究構(gòu)建土壤宏基因組文庫(kù)，利用功能篩選方法，從中克隆新的酯酶基因，并對(duì)其進(jìn)行異源表達(dá)，研究其酶學(xué)性質(zhì)，以期獲得廣譜PAEs 降解活性和良好環(huán)境適應(yīng)性的新酯酶，為有效修復(fù)PAEs污染環(huán)境奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 化學(xué)品和材料 對(duì)硝基苯酚酯均購(gòu)自Sigma 公司（美國(guó)）；T4DNA 連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶、DNA 聚合酶和低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)品購(gòu)自TaKaRa（中國(guó)，大連）并根據(jù)制造商的推薦使用；E. Z. N. A?Plasmid Mini Kit 和E. Z. N. A?Gel Extraction Kit 購(gòu)自O(shè)MEGA（美國(guó)）；三丁酸甘油 酯、羅 丹 明B、PAEs （DMP、DEP、DPrP、DBP、DPP、DnHP）、氨芐青霉素鈉（AMP）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、硫酸卡那霉素（Kana）和5-溴- 4-氯- 3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）購(gòu)自Aladdin（中國(guó)，上海）；蛋白純化試劑盒（His·Bind?Purification Kit）購(gòu)于Novagen 公司（德國(guó)）；胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)于OXOID 公司（英國(guó)）；引物合成和基因測(cè)序由華大基因完成；除另有說(shuō)明外，其它化學(xué)品和試劑均為分析級(jí)，并從商業(yè)來(lái)源購(gòu)買。

1.1.2 培養(yǎng)基的制備

1）LB 培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、NaCl 10.0 g，調(diào)pH 至7.0 并定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。

2）LB 固體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、NaCl 10.0 g，加入w 為1.5%～2%的瓊脂粉，調(diào)pH 至7.0，定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。

3）酯酶篩選培養(yǎng)基：LB 固體培養(yǎng)基中加入100 μg/mL AMP（或100 μg/mL Kana）、0.1 mmol/L IPTG、0.1%（V/V）三丁酸甘油酯和0.1 mg/mL羅丹明B。

1.1.3 細(xì)菌菌株和質(zhì)粒 使用Escherichia coli DH5α 和E. coli BL21（DE3）（本實(shí)驗(yàn)室保存）作為 分 子 克 隆 的 宿 主。 pUC118 （TaKaRa） 和pET-41a（+）（Novagen）分別用于構(gòu)建宏基因組文庫(kù)和基因表達(dá)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 Multiskan Go 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo）、PCR 擴(kuò)增儀（Bio-Rad）、恒溫?fù)u床（上海智誠(chéng)生物有限公司）、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、移液器（Eppendorf）、蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、核酸電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、超聲破碎儀（Sonics）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、立式壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰集團(tuán)股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建和篩選 按參考文獻(xiàn)［27］的方法提取DNA，將提取的總DNA 用BamHⅠ不完全酶切，回收3～8 kb 大小的片段并連接到pUC118 載體中，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到宿主E.coli DH5α，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布到酯酶篩選培養(yǎng)基（含終質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的AMP）上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。含有酯酶基因的陽(yáng)性克隆菌能夠水解培養(yǎng)基中的三丁酸甘油酯，在菌落周圍形成透明圈，羅丹明B可使透明圈清晰可見。因此，挑出具有明顯透明圈的單克隆，進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)對(duì)硝基苯酚乙酸酯（p-NPC2）的水解能力，確定有活性的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。利用NCBI 提供的ORF Finder 進(jìn)行開放閱讀框（open reading frame， ORF）搜索，利用NCBI 提供的BLAST 程序進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)同源搜索。用ClustalX 軟件分析了氨基酸序列相關(guān)酶的保守基序。

1.2.2 酯酶基因的克隆、表達(dá)和純化 通過(guò)PCR

從pUC118 重組質(zhì)粒中擴(kuò)增目的基因est924。在PCR 引物中引入BamHⅠ和HindⅢ限制性酶切位點(diǎn)，引物序列為：Forward：5′- TTATTGGATCCATGCCCAGCCAACAGCTCGC-3′（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）；Reverse：5′-ATCCAAGCTTCTAGCCGTGCTTGCGCACGAA- 3′（下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)）。 PCR 程序?yàn)椋?8 ℃，3 min；98 ℃，30 s ，63 ℃， 30 s，72 ℃，30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。

將擴(kuò)增產(chǎn)物以w=1%的瓊脂糖凝膠電泳，利用E. Z. N. A?Gel Extraction Kit 回收目的片段。純化后的目的片段經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ酶切后與經(jīng)同種酶處理的pET-41a（+） 載體連接，并轉(zhuǎn)入E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于酯酶篩選培養(yǎng)基（100 μg/mL Kana），37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。陽(yáng)性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Kana）中，37 ℃、190 r/min 條件下，恒溫過(guò)夜培養(yǎng)。再以1/100 的接種量將活化的菌液轉(zhuǎn)接到LB 液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Kana）中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h，當(dāng)A600在0.5～0.6 時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L 的IPTG 于30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)8 h。收集菌體超聲波破碎，12 000 r/min 離心5 min 獲得粗酶液。用Ni-NTA 純化目的蛋白，加入φ=50%甘油，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）測(cè)定變性蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量，并用考馬斯亮藍(lán)染色以確定其相對(duì)分子質(zhì)量的大?。?8］。利用BCA蛋白定量測(cè)定純化蛋白濃度。

1.2.3 底物特異性 依據(jù)Fan 等［27］研究方法，使用酯酶/脂肪酶的通用底物p-NPC2、對(duì)硝基苯酚丁酸酯（p-NPC4）、對(duì)硝基苯酚己酸酯（p-NPC6）、對(duì)硝基苯酚辛酸酯（p-NPC8）、對(duì)硝基苯酚葵酸酯（p-NPC10）、對(duì)硝基苯酚月桂酸酯（p-NPC12）、對(duì)硝基苯酚棕櫚酯（p-NPC16）等研究Est924的底物特異性。以pH 7.0、100 mmol/L 的磷酸鉀緩沖液配制100 mmol/L的底物工作液，用于檢測(cè)Est924對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度的底物的水解特性。底物與酶在55 ℃反應(yīng)5 min 后，反應(yīng)液在405 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定A值。最高酶活性計(jì)為100%，以相對(duì)酶活性對(duì)底物作圖，以確定底物特異性。

1.2.4 最適溫度 將適量的重組酯酶Est924 與100 mmol/L 的p-NPC4 為底物混合，分別置于20、30、40、50、55、60 和65 ℃的溫度下孵育5 min后，在405 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定A 值，以確定最適溫度。最高酶活性計(jì)為100%，以相對(duì)酶活性對(duì)溫度作圖。

1.2.5 最適pH 首先配制不同pH 的緩沖液，然后配制不同pH 的p-NPC4 工作液（pH 6.47～9.18）。將適量的重組酯酶Est924 與不同pH 的底物工作液在55 ℃下反應(yīng)5 min 后，在405 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定A 值，以確定最適pH。最高酶活性計(jì)為100%，以相對(duì)酶活性對(duì)pH作圖。

1.2.6 溫度穩(wěn)定性 將適量的酯酶在25、30、40、45、50 ℃等水浴中孵育，不同時(shí)間取樣。以p-NPC4 為底物，55 ℃下反應(yīng)5 min 后，反應(yīng)液在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定A值，測(cè)定其剩余酶活性。以未經(jīng)熱處理的初始酶活定義為100%，以相對(duì)酶活性對(duì)溫度作圖，以評(píng)估酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.7 pH穩(wěn)定性 通過(guò)濃縮菌體進(jìn)行超聲波破碎以減少緩沖液本身對(duì)pH 的影響。適量的重組酯酶Est924 在 不 同pH 的Na2HPO4-KH2PO4緩 沖 液 中，30 ℃水浴孵育，不同時(shí)間進(jìn)行取樣。以p-NPC4 為底物，55 ℃下反應(yīng)5 min后，反應(yīng)液在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定A值，測(cè)定其剩余酶活性。以未經(jīng)處理的酶活性定義為100%，以相對(duì)酶活性對(duì)pH作圖，以確定其pH穩(wěn)定性。

1.2.8 生化試劑對(duì)重組酯酶Est924 的影響 在酶液中加入終濃度為1 mmol/L金屬離子（MgCl2、CaCl2、KCl、MnCl2、CoCl2、AlCl3、CrCl2、FeCl3、EDTA）和終濃度為1% （V/V）的有機(jī)溶劑（Tween-80、Triton X-100）。0 ℃放置24 h 后，以p-NPC4 為底物，55 ℃下反應(yīng)5 min，反應(yīng)液在405 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定A值，測(cè)定其剩余酶活性。以未經(jīng)生化試劑處理的酶活性定義為100%。評(píng)估金屬離子和有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響。

1.2.9 重組酯酶Est924 對(duì)鄰苯二甲酸酯的降解能力 根據(jù)Huang 等［29］方法，檢測(cè)重組酯酶Est924對(duì)鄰苯二甲酸酯的降解能力。反應(yīng)體系1 mL，包括：1.6 μL 的PAEs （DMP、DEP、DPrP、DBP、DPP、DnHP）溶解于50 μL 二甲基亞砜（DMSO）、100 μL 粗 酶 液、848.4 μL pH 7.0 （10 mmol/L）Tris-HCl 緩沖液。以不加酶液為對(duì)照，在45 ℃反應(yīng)3 h 后，用等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取。取適量萃取液點(diǎn)于硅膠板上，進(jìn)行薄層層析（TLC）檢測(cè)。展層劑為：石油醚∶乙酸乙酯∶冰乙酸（體積比為20∶1∶0.5）。展層結(jié)束后取出硅膠板，并在235 nm紫外燈下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建和篩選

從約12 000 個(gè)克隆子的土壤宏基因組文庫(kù)中，篩選獲得了一個(gè)在酯酶篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生水解透明圈的陽(yáng)性菌。對(duì)測(cè)序結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)924 bp大小的酯酶基因，并命名為est924，序列見附加材料1。該基因編碼由307個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白，此蛋白與已報(bào)道的來(lái)源于Synechococcus sp. CC9311的alpha/beta-水解酶具有最高同源性（62.42%），與來(lái)源于未培養(yǎng)微生物的酯酶（QCQ29100.1）具有49.51%的同源性。將Est924 與已報(bào)道的PAEs水解酶多序列比對(duì)分析，結(jié)果如圖1所示，發(fā)現(xiàn)編碼的蛋白中存在典型的催化三元組：位于保守基序G-X-S-X-G 中心的活性位點(diǎn)絲氨酸（S152）、保守的天冬氨酸（D253）和組氨酸（H279）。

2.2 酯酶基因的克隆、表達(dá)和純化

以p-UC118 重組質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到一個(gè)大小924 bp 的基因片段，大小與預(yù)期一致。以pET-41a（+）為載體、E. coli BL21（DE3）為宿主菌構(gòu)建重組菌。重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后的蛋白利用Ni-NTA 分離純化，SDS-PAGE 電泳檢測(cè)純化后蛋白，如圖2所示，箭頭指示目的蛋白，已去除絕大多數(shù)的雜蛋白。目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為58 320，其中包含24 550的融合標(biāo)簽，與預(yù)測(cè)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量相符。

2.3 重組酯酶Est924的酶學(xué)性質(zhì)表征

2.3.1 底物特異性 選用酯酶/脂肪酶的通用底物研究Est924 的底物特異性，結(jié)果見圖3。在所檢測(cè)的對(duì)硝基苯酚酯中，重組酯酶Est924 對(duì)p-NPC4 的活性最高，p-NPC2、p-NPC6、p-NPC8 活性分別為p-NPC4 的50%、20%、14%，對(duì)p-NPC10、p-NPC12、p-NPC16幾乎沒有活性。說(shuō)明酯酶的最適底物為p-NPC4，更適合降解短鏈至中鏈的對(duì)硝基苯酚酯。以p-NPC4 為底物時(shí)，該酶的Km和Vmax分別為77 μmol·L-1和6 μmol·L-1·min-1。

圖1 Est924的多序列比對(duì)分析Fig.1 Multiple sequence alignment of Est924

圖2 重組蛋白Est924的SDS-PAGE鑒定Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of esterase protein

箭頭所指出重組蛋白Est924；M:低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(TaKaRa);1:純化前的重組蛋白Est924; 2:純化后的重組蛋白Est924

圖3 重組蛋白Est924的底物特異性Fig.3 Substrate specificity of Est924

2.3.2 最適溫度 在20、30、40、50、55、60、65 ℃下測(cè)定溫度對(duì)酯酶Est924 活性的影響，結(jié)果見圖4。隨著溫度的升高，酯酶活性逐漸升高，當(dāng)溫度超過(guò)55 ℃時(shí)，酯酶活性下降，說(shuō)明其最適溫度為55 ℃。在30～60 ℃溫度范圍內(nèi)，相對(duì)酶活性均在60%以上，說(shuō)明該酶具有很好的溫度適應(yīng)性。

2.3.3 最適反應(yīng)pH 在pH 6.47 ～9.18 的范圍內(nèi)，以p-NPC4 為底物，測(cè)定酯酶的最適反應(yīng)pH，結(jié)果見圖5。重組酯酶Est924 在pH 8.34 時(shí)活性最高，在pH 7.38～9.18 的范圍內(nèi)，相對(duì)酶活在80%以上，表明該酶在中性至堿性條件下有很好的適應(yīng)性。

2.3.4 溫度穩(wěn)定性 將酯酶Est924 在25、30、40、45、50 ℃分別保溫不同的時(shí)間，以評(píng)估其熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖6。重組酯酶Est924 在25 ℃和30 ℃處理24 h 后，保留80%以上的活性，說(shuō)明酯酶在30 ℃以下十分穩(wěn)定；在40 ℃孵育12 h 后仍保留約50%的酶活性。以上表明該酶在中低溫條件下具有較好的熱穩(wěn)定性。但50 ℃時(shí)酶活性下降較明顯，熱處理2 h的剩余酶活性為20%。

圖4 溫度對(duì)重組酯酶Est924活性的影響Fig.4 Effect of temperature on activity of Est924

圖5 pH對(duì)重組酯酶Est924活性的影響Fig.5 Effect of pH on activity of Est924

2.3.5 pH 穩(wěn)定性 重組酯酶Est924 在不同pH（6.47～9.18）緩沖液中處理不同的時(shí)間后檢測(cè)剩余酶活性，以此確定pH 對(duì)酯酶穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖7。pH 6.47 時(shí)，孵育5 h 酯酶活性下降到50%左右；pH 6.98 時(shí)，12 h 酯酶活性下降至初始的70%左右；在pH 7.38～9.18 的范圍內(nèi)，24 h 仍保留70%以上的初始活性。說(shuō)明此酶在堿性條件下具有良好的穩(wěn)定性，能夠很好的適應(yīng)pH 的變化，是一種耐堿性酯酶。

2.3.6 生化試劑對(duì)重組酯酶Est924 的影響 酶促反應(yīng)速率會(huì)受化學(xué)物質(zhì)的影響。表1 的結(jié)果顯示，多數(shù)金屬離子對(duì)Est924 表現(xiàn)為不同程度的抑制作用，Mg2+、Ca2+、K+、Mn2+、Co2+、Al3+、Cr2+等的活性 分 別 為80.1%、 90.2%、 86.2%、 68.4%、31.3%、64.1%、78.2%。Fe3+以及表面活性劑Tween-80和Triton X-100等對(duì)Est924有不同程度的激活作用，酶活性分別為127.2%、107.1% 和140.0%。金屬螯合劑EDTA 對(duì)酯酶Est924 表現(xiàn)為激活作用，說(shuō)明酯酶Est924 是非金屬酶，其催化活性不依懶于金屬離子。

圖6 溫度對(duì)重組酯酶Est924穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of temperature on stability of Est924

圖7 pH對(duì)重組酯酶Est924穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of pH on stability of Est924

2.4 重組酯酶Est924對(duì)鄰苯二甲酸酯的降解能力

以DMP、DEP、DPrP、DBP、DPP、DnHP 為底物來(lái)研究酯酶對(duì)PAEs降解作用，TLC結(jié)果如圖8所示。圖中對(duì)照組條帶為PAEs，條帶的明暗代表著PAEs 量的多少。實(shí)驗(yàn)組5、7、9 中PAEs 條帶已基本消失，DPrP、DBP 和DPP 基本被降解完全；實(shí)驗(yàn)組1 和3 中PAEs 條帶明顯變淡。以上結(jié)果表明重組酯酶Est924 對(duì)DMP、DEP、DPrP、DBP 和DPP 具有很好的降解能力。實(shí)驗(yàn)組11 中PAEs 條帶與對(duì)照組12 相比變淡，但還比較明顯，說(shuō)明該酶對(duì)DnHP 的降解能力較弱。仔細(xì)觀察實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)，在1、3、5、7、9 的PAEs 條帶下方、點(diǎn)樣點(diǎn)上方位置，有新條帶產(chǎn)生，而在對(duì)照組中沒有。推測(cè)，新條帶是PAEs 經(jīng)水解后產(chǎn)生的單酯，重組酯酶Est924對(duì)鄰苯二甲酸酯的降解作用是通過(guò)逐步脫酯化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。

表1 生化試劑對(duì)酯酶Est924 活性的影響Table 1 Effect of the various chemical reagents on activity of Est924

3 討 論

鄰苯二甲酸酯是一類全球性的重要環(huán)境污染物。其中，短鏈烷基酯（C1～C4）的溶解度比長(zhǎng)鏈同系物高，毒性更大［30］。美國(guó)環(huán)保局（EPA）將鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸正二辛酯（DOP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBP）、DBP、DEP、DMP 等6 種PAEs 列為優(yōu)先控制的有毒污染物，中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站將DEP、DMP 和DOP 等3 種PAEs 列為優(yōu)先控制污染物［31］。因此，找到廣譜高效降解PAEs 且具有良好環(huán)境適應(yīng)性的降解酶尤為重要。

本研究利用宏基因組技術(shù)從土壤中挖掘出新酯酶Est924，并研究了其酶學(xué)性質(zhì)以及對(duì)環(huán)境污染物PAEs 的生物降解。通過(guò)對(duì)Est924 進(jìn)行序列分析，推測(cè)活性位點(diǎn)與絲氨酸、天冬氨酸和組氨酸形成的催化三聯(lián)體有關(guān)，同時(shí)在活性絲氨酸位點(diǎn)周圍含有典型的保守五肽結(jié)構(gòu)G-X-S-X-G，這說(shuō)明Est924 屬于酯酶家族。底物特異性結(jié)果顯示，重組酯酶Est924 對(duì)p-NPC4 的活性最高，對(duì)p-NPC2 的活性為50%，對(duì)p-NPC6 和ρ-NPC8 活性非常低，而當(dāng)碳鏈長(zhǎng)度大于10 時(shí)幾乎沒有活性，這與酯酶作用底物的碳鏈長(zhǎng)度小于10 具有一致性［32］。重組酯酶Est924 的最適溫度為55 ℃，在30～60 ℃溫度范圍內(nèi)，相對(duì)酶活性均在60%以上；該酶在25 ℃和30 ℃處理24 h 后，保留80%以上的活性，在40 ℃孵育12 h后仍保留約50%的酶活性。這表明該酶具有很好的溫度適應(yīng)性和較好的熱穩(wěn)定性。重組酯酶Est924在pH 8.34時(shí)活性最高，在pH 7.38～9.18 的范圍內(nèi)，相對(duì)酶活在80%以上；在pH 7.38～9.18 的環(huán)境下處理24 h，仍保留70%以上的酶活性。這表明該酶是一個(gè)耐堿酶，且在中性至堿性條件下有很好的適應(yīng)性。研究重組酯酶Est924 對(duì)PAEs 的降解能力發(fā)現(xiàn)，該酶對(duì)DMP、DEP、DPrP、DBP 和DPP 均具有很好的降解能力。以上研究數(shù)據(jù)證明，重組酯酶Est924 是一個(gè)具有良好穩(wěn)定性和環(huán)境適應(yīng)性的耐堿酯酶，且對(duì)PAEs的降解具有廣譜的底物特異性。

圖8 TLC分析Est924對(duì)鄰苯二甲酸酯的降解能力Fig.8 PAEs degradation ability analysis of Est924 by TLC

目前，也有降解PAEs 堿性酯酶的報(bào)道，它們與Est924 有著32%以上的同源性，基本的酶學(xué)性質(zhì)有一些相似之處。其中EstZ1 在pH 7.0～9.5 的范圍內(nèi)維持50%以上的活性，對(duì)DEP 有降解作用，對(duì)其它PAEs 無(wú)水解作用［18］；EstPt1 是一個(gè)耐熱堿性酯酶，最適溫度高達(dá)85 ℃，有著良好的熱穩(wěn)定性，但只有水解DBP 的數(shù)據(jù)［23］；酯酶EstSP1 的最適pH（9.0）高于酯酶Est924，能很好的耐受有機(jī)溶劑（甲醇和DMSO），最適溫度為40 ℃，在25 ℃下處理2 h，酶活性下降為初始的37%，穩(wěn)定性較差［33］。近些年，克隆的能降解PAEs 的酯酶/脂肪酶數(shù)量還不多。來(lái)源于Nocardia erythropolis 的脂肪酶，其最適pH 為8.6，在pH 7.0～8.0 范圍穩(wěn)定，能分解大多數(shù)PAEs，底物譜較廣，但其氨基酸序列未報(bào)道［34］。DphB 是一種冷適應(yīng)酶，最適溫度為10 ℃，能催化DPrP、DBP、DPP 的水解［20］?？寺∮贑amelimonas sp. M11 的酯酶是一種金屬酶，不能水解DMP，當(dāng)pH 大于8.0 時(shí)該酶幾乎沒有活性［19］。BDS4 是一個(gè)對(duì)PAEs 和阿魏酸酯均具有降解 作 用 的 酯 酶，能 水 解3 種 短 鏈PAEs［24］；BaCEs04 最適溫度為60 ℃，高于酯酶Est924，在pH 5.5～8.0 范圍內(nèi)穩(wěn)定，只能水解PAEs（C1 ～C4） 到 相 應(yīng) 的 單 酯［25］。來(lái) 源 于Acinetobacter sp.M673的酯酶［26］與Est924底物譜類似，該酶最適反應(yīng)pH 為7.5，當(dāng)pH 值超過(guò)6.0 和9.0 時(shí)，酶活性急劇下降。酯酶GoEst15 具有廣譜的底物特異性，能夠水解幾乎所有的PAEs，在pH 7.5～8.0 條件下處理不到2 h，幾乎失活，在40 ℃活性迅速下降［29］，其pH和溫度穩(wěn)定性有待提高。

值得注意的是，現(xiàn)階段所報(bào)道的酯酶多水解PAEs 的一個(gè)酯鍵，生成單酯；僅有個(gè)別酶能水解兩個(gè)酯鍵，如GoEst15 能將PAEs 水解為相應(yīng)的單酯，與GoEstM1 共表達(dá)后將單酯水解為鄰苯二甲酸［29］；從Bacillus sp. K91 基因組克隆了一個(gè)酯酶基因CarEW 能水解鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）的兩個(gè)酯鍵生成鄰苯二甲酸［35］。本文Est924 具有良好的酶學(xué)性質(zhì)，但其對(duì)PAEs 的降解機(jī)制需要繼續(xù)深入研究。后續(xù)我們將利用突變技術(shù)對(duì)Est924定向改造，獲得更優(yōu)良的突變酶，同時(shí)闡述其對(duì)PAEs 的降解機(jī)理，從而獲得更好的應(yīng)用前景和理論研究基礎(chǔ)。