楊祖閣 張趙一淳 任昊喆 王若欣 于世賓 張婧

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病是口腔臨床的常見病，可累及咀嚼肌、顳下頜關(guān)節(jié)及周圍組織[1]，咀嚼肌酸困、疼痛和功能障礙是其主要癥狀之一。盡管顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病的致病因素眾多，咬合因素在其中一直備受關(guān)注[2]。已有臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)咬合異常患者的咀嚼肌對(duì)疼痛更加敏感且肌電活動(dòng)明顯改變[3-4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)異常咬合可導(dǎo)致咀嚼肌疼痛閾值顯著降低[5-6]，該課題組前期研究發(fā)現(xiàn)異常咬合可以造成大鼠咀嚼肌超微結(jié)構(gòu)改變[7]。

本實(shí)驗(yàn)旨在全面評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)性牙齒移動(dòng)引起的咬合干擾造成咀嚼肌損傷的程度，觀察咬肌的組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)變化，及骨骼肌損傷標(biāo)志物結(jié)蛋白(desmin)和骨骼肌肌鈣蛋白抑制亞基(skeletal muscle troponin I,sTnI)蛋白的表達(dá)和血清中肌酸激酶(creatine kinase,CK)、 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和肌紅蛋白(myoglobin,Mb)含量的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供54 只8 周齡SD雌性大鼠(體重200～220 g)，隨機(jī)平均分為對(duì)照組(Con)、咬合干擾組(Exp)、咬合干擾+EDTA注射組(Exp+EDTA)(n=18)。

咬合干擾組大鼠，腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(Sigma,美國(guó))進(jìn)行麻醉，在左側(cè)上頜第二、第三磨牙之間，及右側(cè)下頜第二、第三磨牙之間塞入正畸皮圈(1/8，3M，美國(guó))，以第一、第二磨牙為支抗，以皮筋的膨脹力向遠(yuǎn)中推第三磨牙移動(dòng)約半個(gè)牙尖的距離(約0.8 mm)，改變雙側(cè)上下第三磨牙之間的咬合關(guān)系，確保皮筋不脫落不高于咬合平面，保持該間隙直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。對(duì)照組大鼠，將皮圈塞入后立即取出，其余實(shí)驗(yàn)方法同咬合干擾組。Exp+EDTA注射組大鼠，在分牙操作前將Ca2+螯合劑EDTA-Na2(90 mg/kg，Sigma，美國(guó))溶于0.4 ml的生理鹽水中，雙側(cè)咬肌皮下各注射0.2 ml，實(shí)驗(yàn)期間每天注射1 次。

1.2 取材和樣本制備

實(shí)驗(yàn)后1、2、4 周分別將Con組、Exp組、Exp+EDTA注射組(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=6)大鼠以1%的戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉，取腹主動(dòng)脈血后處死，快速取雙側(cè)咬肌。取其中3 只大鼠雙側(cè)咬肌前中部組織，4 ℃條件下固定，脫水，石蠟包埋，切片(厚約5 μm)，蘇木素-伊紅染色(n=3)；取雙側(cè)咬肌后部組織，修整，4%戊二醛和1%四氧化鋨分別固定2 h，丙酮梯度脫水，包埋，超薄切片后以透射電鏡(JEOL，日本)觀察(n=3)。取其余3 只大鼠雙側(cè)咬肌前中部組織，4 ℃條件下勻漿，加入緩沖液和溴酚藍(lán)，80 ℃加熱5 min變性，待Western blot檢測(cè)；取雙側(cè)咬肌后部組織，4 ℃條件下進(jìn)行勻漿，待線粒體內(nèi)Ca2+含量檢測(cè)。

1.3 線粒體內(nèi)Ca2+含量檢測(cè)

在4 ℃條件下，以組織線粒體分離試劑盒(碧云天，中國(guó))提取咬肌線粒體，原子吸收分光光度計(jì)(日立，日本)檢測(cè)Ca2+含量，BCA法進(jìn)行線粒體蛋白定量，計(jì)算線粒體內(nèi)Ca2+含量(n=3)。

1.4 Western blot檢測(cè)

采用SDS-不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))、12% Laemmli分離膠電泳，以半干電轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad，美國(guó))15 V轉(zhuǎn)膜15 min，1%BSA+TBS封閉30 min，4 ℃一抗過夜(desmin和actin，Sigma，美國(guó)；sTnI抗體為第四軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系余志斌教授所贈(zèng)[8])，耦聯(lián)紅外熒光二抗孵育1 h，Odyssey紅外線掃描儀(Li-Cor,美國(guó))掃描成像(n=3)。

1.5 血清學(xué)檢測(cè)

動(dòng)脈血室溫靜置1 h，4 ℃過夜，在4 ℃條件下4 000 r/min離心10 min，取上清液分裝。以全自動(dòng)生化儀(Roche，瑞士)檢測(cè)大鼠血清中CK、LDH的含量，以ELISA試劑盒(ADL)檢測(cè)血清中Mb含量(n=6)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 組織學(xué)變化

Con組大鼠咬肌組織形態(tài)正常，肌纖維橫截面為圓形或多角形，細(xì)胞核位于邊緣。各時(shí)間點(diǎn)咬合干擾組肌纖維形態(tài)基本同對(duì)照組，無明顯炎性表現(xiàn)(圖 1)。

2.2 超微結(jié)構(gòu)改變

Con組大鼠咬肌肌原纖維排列整齊，線粒體大小均勻，排列整齊，嵴較多。Exp組肌纖維的部分線粒體變大變圓，基質(zhì)電子密度降低，嵴斷裂變短變少，甚至消失，未見肌原纖維排列紊亂，左右側(cè)無明顯差異。Exp+EDTA阻斷細(xì)胞內(nèi)Ca2+后，可見咬肌細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)基本正常(圖 2)。

2.3 線粒體內(nèi)Ca2+含量變化

各組大鼠左右兩側(cè)咬肌線粒體Ca2+含量無明顯差異(P=0.282)，各時(shí)間點(diǎn)Exp組線粒體內(nèi)的Ca2+含量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而注射Ca2+阻斷劑后，線粒體內(nèi)Ca2+含量回落到Con組水平(P>0.05)(圖3)。

2.4 骨骼肌損傷標(biāo)志物檢測(cè)

各時(shí)間點(diǎn)Exp組大鼠咬肌內(nèi)的骨骼肌損傷標(biāo)志物desmin和sTnI在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均沒有明顯變化(圖 4)，Exp組大鼠血清中CK、LDH和Mb與Con組間均無明顯差異(圖 5)。

圖 1 大鼠咬肌組織切片HE染色

圖 2 透射電鏡觀察大鼠咬肌超微結(jié)構(gòu)(×10 000)

圖 3 大鼠咬肌線粒體Ca2+含量

3 討 論

目前，在骨骼肌運(yùn)動(dòng)損傷的相關(guān)研究中Ca2+環(huán)境失調(diào)理論是主要機(jī)制之一，骨骼肌處于不適應(yīng)的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下，細(xì)胞膜上的牽張性陽離子通道開放，Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量增加，線粒體不僅為細(xì)胞提供能量，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載時(shí)，線粒體便會(huì)攝入Ca2+，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+的平衡。但是當(dāng)線粒體內(nèi)Ca2+過多時(shí)，便會(huì)影響線粒體的功能，破壞其形態(tài)，最終影響肌細(xì)胞的功能[9-10]。

圖 4 大鼠咬肌中desmin 和sTnI的含量

圖 5 大鼠血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌紅蛋白(Mb)含量

有研究表明，加高/降低動(dòng)物咬合使得咬肌細(xì)胞及其線粒體內(nèi)Ca2+含量增加，并出現(xiàn)骨骼肌損傷特征性表現(xiàn)，如紅細(xì)胞滲出、白細(xì)胞浸潤(rùn)等組織學(xué)炎性變現(xiàn)，及線粒體腫脹、肌漿網(wǎng)空泡性變、肌纖維排列紊亂等超微結(jié)構(gòu)的變化。Akagawa等[11]加高Wistar大鼠垂直咬合距離，觀察到咬肌及顳肌前束出現(xiàn)組織學(xué)改變，以咬肌深層為重。祁冬等[12]在兔單側(cè)前磨牙粘固咬合板造成咬合創(chuàng)傷，10 d后觀察咬肌組織的超微結(jié)構(gòu)和線粒體鈣離子含量，發(fā)現(xiàn)單純咬合創(chuàng)傷組出現(xiàn)明顯的肌肉損傷改變，肌原纖維排列疏松，線粒體腫脹以及線粒體鈣離子含量明顯增加等表現(xiàn)。Bani等[13]降低大鼠單側(cè)咬合后，觀察到大鼠實(shí)驗(yàn)側(cè)咬肌出現(xiàn)廣泛的線粒體腫脹等超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)，并且肌組織內(nèi)鈣離子含量明顯增加。而給予Ca2+阻斷劑后，可以抑制細(xì)胞和線粒體內(nèi)Ca2+超載，并緩解超微結(jié)構(gòu)損傷[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與加高動(dòng)物咬合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)引起的咬合干擾未引起大鼠咬肌組織學(xué)改變，但可以引起超微結(jié)構(gòu)的改變，如部分線粒體形態(tài)變大變圓，嵴等特征性結(jié)構(gòu)消失，咬肌細(xì)胞線粒體內(nèi)Ca2+含量的明顯增加，且注射Ca2+阻斷劑可明顯緩解超微結(jié)構(gòu)損傷。

近來研究認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)Desmin和sTnI丟失是骨骼肌運(yùn)動(dòng)損傷的敏感指標(biāo)[15-16]。Desmin是一種中間絲蛋白，是構(gòu)成脊椎動(dòng)物骨骼肌、心肌和平滑肌細(xì)胞骨架的主要成份，連接于Z線之間，限制肌節(jié)在肌肉收縮時(shí)被過分牽拉。有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致肌細(xì)胞中desmin斷裂[17]， 而細(xì)胞骨架蛋白的破壞可導(dǎo)致超微結(jié)構(gòu)。肌鈣蛋白(troponin,Tn)屬于橫紋肌結(jié)構(gòu)蛋白，由C、T、I 3 種亞基組成，骨骼肌肌鈣蛋白抑制亞基(sTnI)，是肌鈣蛋白I的一種亞型，參與調(diào)節(jié)橫紋肌收縮。sTnI在骨骼肌細(xì)胞中主要以結(jié)構(gòu)蛋白的形式結(jié)合在肌原纖維上，當(dāng)骨骼肌發(fā)生損傷后，sTnI與肌原纖維解離，進(jìn)入血循環(huán)中[18]。本研究中未見肌組織中sTnI和desmin明顯丟失，與電鏡觀察結(jié)果中超微結(jié)構(gòu)損傷僅局限于線粒體形態(tài)改變，未見肌原纖維排列紊亂相印證。

肌酸激酶(CK)存在于肌肉和腦等組織的線粒體和細(xì)胞漿中，與肌細(xì)胞中能量運(yùn)轉(zhuǎn)和ATP再生有關(guān)；乳酸脫氫酶(LDH)廣泛存在全身各組織中，特別是肌組織，與細(xì)胞內(nèi)無氧糖酵解有關(guān)；肌紅蛋白(Mb)僅存在于心肌與骨骼肌中。正常情況下，這3 種物質(zhì)在血清中的含量非常低，但如果肌細(xì)胞發(fā)生損傷，細(xì)胞膜破裂，這3 種物質(zhì)便會(huì)進(jìn)入血液。大量研究表明，骨骼肌損傷即刻出現(xiàn)血中CK、LDH、Mb活性明顯升高[19-20]。咬合干擾組大鼠的血清中未見CK、LDH和Mb含量升高，提示實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)形成的咬合干擾并不會(huì)造成咬肌細(xì)胞胞膜破裂的嚴(yán)重?fù)p傷。

綜上，實(shí)驗(yàn)性牙移動(dòng)形成的咬合干擾可造成大鼠咬肌輕微損傷，主要表現(xiàn)為超微結(jié)構(gòu)變化，且與細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)有關(guān)。