郭榮榮 張繚云

1.山西醫(yī)科大學(xué) (山西 太原，030001) 2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

藥物性肝損傷(DILI)是一類復(fù)雜疾病，根據(jù)其病理特征分為肝細(xì)胞損傷型、膽汁淤積型、混合型和肝血管損傷型，臨床中最常見的是肝細(xì)胞損傷型[1]。DILI可分為固有型肝損害和特異質(zhì)型肝損害，其中藥物固有型肝損害主要為劑量依賴性，由于藥物或其代謝物的直接毒性導(dǎo)致肝損傷，并且具有較短的潛伏期，在動(dòng)物模型中是可重復(fù)的，具有可預(yù)測性，例如對(duì)乙酰氨基酚(APAP)過量。然而，絕大多數(shù)DILI是特異性的或不可預(yù)測的，并且在大多數(shù)情況下，常規(guī)動(dòng)物模型藥理學(xué)及毒理學(xué)無法確定后續(xù)臨床毒性的風(fēng)險(xiǎn)[2]。DILI的發(fā)病機(jī)制是多種因素相互作用的結(jié)果，這些因素盤根錯(cuò)節(jié)，已經(jīng)成為近年來研究的熱門話題，但其損傷機(jī)制目前尚未完全闡明，本文就近幾年DILI的直接肝損傷機(jī)制、特異質(zhì)性肝損傷機(jī)制、線粒體功能損傷、遺傳等方面進(jìn)行綜述。

1 藥物的直接肝損傷機(jī)制

藥物通過自由基或代謝介質(zhì)使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，損傷肝線粒體導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷；也可通過改變細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)構(gòu)，激活凋亡途徑等。Kaplowitz[3]對(duì)DILI的發(fā)病機(jī)制提出了特異性“上游”事件和非特異性“下游”事件的假說?！吧嫌巍笔录核幬锘蚱浯x產(chǎn)物對(duì)肝臟的直接損傷；“下游”事件：肝細(xì)胞內(nèi)不同損傷與保護(hù)通路之間的失衡。Russmann等[4]將DILI的過程概括為三個(gè)步驟：藥物或其代謝產(chǎn)物直接損傷引起肝細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)；線粒體膜通透性改變；線粒體膜通透性改變使三磷酸腺苷合成減少，最終導(dǎo)致肝臟細(xì)胞的壞死或凋亡。

肝臟中藥物的代謝可分為兩相。第Ⅰ相代謝主要是親脂性藥物通過細(xì)胞色素P450酶(CYP)氧化、還原和水解等反應(yīng)形成一系列極性基團(tuán)；第Ⅱ相代謝也是主要通過CYP450代謝產(chǎn)生親水性且更容易被清除的代謝產(chǎn)物。藥物誘導(dǎo)肝損傷的發(fā)病機(jī)制通常涉及有毒藥物或其代謝物的參與，多與劑量相關(guān)，具有潛伏期短的特點(diǎn)。然而，在使用呋喃妥因、磺胺類藥物(例如紅霉素和阿莫西林-克拉維酸鹽)等藥物或甚至停藥后藥物經(jīng)過非常長的潛伏期后才出現(xiàn)免疫反應(yīng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)例外情況。在發(fā)生DILI的藥物中，對(duì)APAP的劑量依賴性和其自身的肝毒性是DILI發(fā)生的最常見原因，是可預(yù)測的。APAP主要由肝臟代謝，其主要代謝產(chǎn)物是葡萄糖醛酸苷或硫酸鹽結(jié)合物，經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟，由膽汁或腎臟排泄。而少量APAP通過CYP450酶(主要是CYP2E1)在肝臟中轉(zhuǎn)化為毒性親電子芳基化代謝物N-乙酰基-對(duì)苯醌亞胺(NAPQI)，該毒性代謝產(chǎn)物經(jīng)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)解毒。長期過量的APAP使葡萄糖醛酸化和硫酸化途徑飽和，過多的NAPQI會(huì)耗盡GST滿足其代謝，并且與蛋白巰基共價(jià)結(jié)合形成蛋白加合物，造成氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙，引起急性肝小葉中心壞死[5]。參與APAP代謝的代謝酶中，CYP3A4也必不可少，有研究表明，增加CYP3A4酶的活性可能使APAP的毒性作用更加顯著。相反，當(dāng)CYP3A4酶的活性受到抑制時(shí)，因APAP過量引起的肝毒性可顯著降低。這種可預(yù)測的APAP毒性過程使得N-乙酰半胱氨酸仍然是今天APAP過量首選的治療藥物。

2 藥物的特異質(zhì)性肝損傷機(jī)制

盡管在臨床藥物開發(fā)之前，在體外測試系統(tǒng)和各種動(dòng)物模型中進(jìn)行了廣泛的安全性測試，但是該測試經(jīng)常無法識(shí)別潛在的肝毒性藥物。廣義上，藥物的特異質(zhì)性肝損傷機(jī)制可分為兩類：超敏反應(yīng)型(也稱免疫特異質(zhì)性肝損傷)和代謝特異質(zhì)性肝損傷。

2.1 免疫特異質(zhì)性肝損傷 免疫特異質(zhì)性肝損傷患者可出現(xiàn)發(fā)熱、嗜酸粒細(xì)胞增多、皮疹、自身抗體陽性和史蒂文斯-約翰遜綜合征。非免疫反應(yīng)較少出現(xiàn)上述特征，并且免疫介導(dǎo)的DILI具有較長的潛伏期。

2.1.1 肝臟的固有免疫 常見的固有免疫細(xì)胞包括單核巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和自然殺傷T(NKT)細(xì)胞等，當(dāng)發(fā)生DILI時(shí)，受損傷的肝細(xì)胞周圍可見大量的巨噬細(xì)胞浸潤，同時(shí)可以觀察到骨髓中前體巨噬細(xì)胞增殖[6]。高遷移率族蛋白B1是一種細(xì)胞損傷相關(guān)模式，當(dāng)肝臟細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死時(shí)可以被釋放，細(xì)胞損傷相關(guān)模式還可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤。肝臟含有豐富的淋巴細(xì)胞，從肝臟分離的自然殺傷(NK)細(xì)胞可能對(duì)各種細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，而NKT細(xì)胞一般要求在白細(xì)胞介素(IL)-2的存在才能發(fā)揮效應(yīng)。有研究表明，發(fā)生DILI時(shí)，NK細(xì)胞可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的募集，同時(shí)NK細(xì)胞也可以分泌IL-17，IL-17有不同的免疫調(diào)節(jié)作用[7]。然而，其他研究表明，由α-半乳糖神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷，NKT細(xì)胞被特異性激活，并產(chǎn)生大量IL-17，其抑制了炎癥的發(fā)展[8]。這兩種不同的觀點(diǎn)，需要我們進(jìn)一步研究NK/NKT在肝臟先天免疫中的作用。

2.1.2 肝臟的適應(yīng)性免疫 適應(yīng)性免疫反應(yīng)可能是DILI發(fā)生的最后共同事件。由于藥物或藥物的活性代謝產(chǎn)物與肝細(xì)胞內(nèi)共價(jià)蛋白結(jié)合，形成藥物-蛋白質(zhì)加合物，被識(shí)別為抗原而激活外周血淋巴細(xì)胞，引起抗體形成或T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞裂解，誘導(dǎo)免疫介導(dǎo)的反應(yīng)或直接肝毒性，而發(fā)生超敏反應(yīng)，占所有特異質(zhì)性DILI病例的23%～37%。此外，由于血液循環(huán)使得肝細(xì)胞對(duì)藥物的攝入增加，形成更多的活性代謝物，從而增加了發(fā)生DILI的風(fēng)險(xiǎn)。目前已經(jīng)提出了一些不同的假設(shè)來解釋DILI適應(yīng)性免疫激活模式，如半抗原理論假說、 P-i 理論假說和改變肽庫譜假說。

半抗原理論假說：藥物的代謝產(chǎn)物在肝細(xì)胞中經(jīng)過共價(jià)結(jié)合形成藥物-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這些復(fù)合物被抗原呈遞細(xì)胞呈遞給人類白細(xì)胞抗原(HLA)Ⅱ分子，然后與CD4+T細(xì)胞受體相互作用，激活下游的細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞[9]。然后由細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量針對(duì)抗原的特異性抗體。如麻醉吸入劑氟烷，一些抗驚厥藥如苯妥英，以及某些抗生素如甲氧芐啶、磺胺甲噁唑、頭孢唑啉和環(huán)丙沙星[10]。這些藥物與肝臟蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素P450酶共價(jià)結(jié)合，作為半抗原-抗原加合物呈遞給MHCⅡ類分子，從而引發(fā)激活CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。T細(xì)胞反過來表達(dá)Fas配體和腫瘤壞死因子，它通過在肝細(xì)胞表面大量表達(dá)的死亡受體介導(dǎo)肝細(xì)胞死亡[11]。導(dǎo)致免疫激活的易感HLA多態(tài)性本身并不能完全解釋肝毒性，因?yàn)榇蠖鄶?shù)鑒定的與毒性相關(guān)的HLA單倍型在一般人群中非常常見，而特異質(zhì)性DILI 是罕見的事件。因此，并非所有具有易感HLA基因多態(tài)性的個(gè)體在暴露于藥物時(shí)都表現(xiàn)出特異質(zhì)性DILI，這可能與肝臟固有的免疫狀態(tài)和調(diào)節(jié)免疫耐受有關(guān)[10]。

P-i假說即藥理學(xué)相互作用：一些藥物可以直接與主要組織相容性復(fù)合物分子相互結(jié)合，以激活免疫系統(tǒng)。如利多卡因、塞來昔布、卡馬西平、希美加曲，不需要共價(jià)結(jié)合蛋白質(zhì)形成新抗原就能刺激并致敏T淋巴細(xì)胞。相關(guān)研究已證實(shí)，希美加曲直接抑制肽可與HLA DRB1*0701結(jié)合，支持藥物與該HLA結(jié)合位點(diǎn)的直接相互作用[12]。

改變肽庫譜假說：某些藥物可能使內(nèi)源性肽錯(cuò)配到HLA，導(dǎo)致自身免疫。阿巴卡韋皮疹和史蒂文斯-約翰遜綜合征[13]可解釋這一假說。阿巴卡韋與HLA-B*57:01非共價(jià)結(jié)合，改變抗原裂縫的形狀和化學(xué)結(jié)構(gòu)，隨后呈遞給T細(xì)胞，驅(qū)動(dòng)CD8+T細(xì)胞活化，最后表現(xiàn)出超敏反應(yīng)綜合征。

部分DILI還有其他假設(shè)，如多重決定因素相互作用假說，該假說指出多種危險(xiǎn)因素(如多態(tài)性、年齡、性別、既往病癥)可能重疊在一起誘導(dǎo)DILI[14]。

2.2 代謝特異質(zhì)性肝損傷 代謝特異質(zhì)性肝損傷與藥物代謝酶相關(guān)性更大，其中CYP450酶是主要的藥物代謝酶。藥物代謝酶的遺傳多態(tài)性，常使CYP450酶系統(tǒng)代謝能力低下，藥物或其中間代謝產(chǎn)物積累而導(dǎo)致DILI發(fā)生，特征為具有較長潛伏期，無過敏癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，異煙肼可顯著提高CYP2E1酶的敏感性，導(dǎo)致肝損傷的危險(xiǎn)提高3～4倍。后來又發(fā)現(xiàn)參與藥物代謝的Ⅱ相代謝酶GST也存在遺傳多態(tài)性，GST可結(jié)合氧化修飾產(chǎn)物，降低細(xì)胞毒性。研究報(bào)道，GSTM1和GSTT1基因缺失可導(dǎo)致藥物代謝酶活性降低甚至不發(fā)揮其本身的作用。在GSTM1和GSTT1基因缺失的患者中，DILI的發(fā)生率增加[15]。而有研究卻顯示GSTM1和GSTT1缺失基因型與肝毒性均無顯著相關(guān)性[16]，因此可見，GST基因型在抗結(jié)核藥物所致DILI中的作用仍有待進(jìn)一步研究。

3 線粒體功能損傷

由藥物所致的線粒體功能損傷常常是多種機(jī)制作用的結(jié)果。線粒體為細(xì)胞生命提供直接能量并維持肝細(xì)胞中的環(huán)境平衡,也是氧化應(yīng)激損傷的重要目標(biāo)細(xì)胞器。活性代謝產(chǎn)物的廣泛生產(chǎn)是肝損傷的關(guān)鍵步驟[17],如CYP 450酶代謝產(chǎn)生的新電子基和自由基，會(huì)影響酶的活性并且能攻擊、破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜及膜受體，從而使肝細(xì)胞受損。APAP攝入體內(nèi)后，APAP中間代謝產(chǎn)物NAPQI和線粒體衍生的活性氧損傷線粒體DNA,并激活c-Jun N末端激酶信號(hào)通路，線粒體衍生的活性氧擴(kuò)增導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，使體內(nèi)超氧化物水平增高，鈣穩(wěn)態(tài)改變，減少ATP的合成，增加NF-κB p65的活化和促炎因子腫瘤壞死因子-α基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死[18]。異煙肼誘導(dǎo)的DILI中，異煙肼在CYP2E1的催化下生成毒性代謝產(chǎn)物乙酰肼和肼從而損傷肝細(xì)胞，乙酰肼與肝細(xì)胞內(nèi)的生物大分子共價(jià)結(jié)合，繼續(xù)水解可成為具有肝毒性的肼，導(dǎo)致肝內(nèi)的GSH耗竭而引起線粒體膜通透性改變，損傷肝細(xì)胞[19]。也有可能產(chǎn)生共價(jià)藥物-蛋白質(zhì)加合物，形成半抗原而激活免疫應(yīng)答。當(dāng)然也可以由于異煙肼或其代謝物直接引起線粒體損傷，這均會(huì)導(dǎo)致線粒體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)和能量穩(wěn)態(tài)失去平衡[14]。若當(dāng)前線粒體已經(jīng)存在這種缺陷，即使是異煙肼尚未到達(dá)刺激機(jī)體肝細(xì)胞破壞的濃度，也可能由于復(fù)合物功能的潛在損害，而導(dǎo)致顯著的肝細(xì)胞損傷。相關(guān)研究已經(jīng)表明，線粒體損傷的其他機(jī)制還包括：在線粒體進(jìn)行的β-氧化受損，線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p，線粒體膜破壞和線粒體DNA損傷，分別由他莫昔芬、丙戊酸、雙氯芬酸和他克林引起[20]。另外，由于藥物或其代謝產(chǎn)物與膽管細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，影響膽管細(xì)胞內(nèi)膽汁酸的正常分泌，導(dǎo)致膽汁排出受阻，膽汁淤積，大量的膽汁酸鹽造成肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞的間接損傷[21]。

因此，藥物的直接肝毒性對(duì)線粒體的損傷涉及結(jié)構(gòu)變化和功能紊亂等多種機(jī)制。任何一種藥物對(duì)線粒體的損傷都是多途徑相互作用，包括線粒體DNA的復(fù)制和表達(dá)受到抑制、內(nèi)膜通透性增加、電子傳遞體系的抑制和新陳代謝的抑制等，是一個(gè)復(fù)雜的過程。

4 遺傳因素

以前的遺傳關(guān)聯(lián)研究主要集中在參與藥物攝取、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)或解毒的候選基因中，可用于預(yù)測藥物藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)參數(shù)。例如，N-乙?；D(zhuǎn)移酶2基因活性降低和CYP2E1介導(dǎo)的氧化代謝活性增加與異煙肼肝毒性有關(guān)。然而，這些關(guān)聯(lián)常常在獨(dú)立隊(duì)列研究中不能復(fù)制。識(shí)別遺傳關(guān)聯(lián)的另一種方法是在沒有特定預(yù)先假設(shè)的情況下收集DILI病例和群體對(duì)照中的整個(gè)人類基因組。在DILI中首次成功進(jìn)行的GWA研究發(fā)現(xiàn)，氟氯西林誘導(dǎo)的肝損傷與6號(hào)染色體上的HLA-B*5701等位基因之間存在非常強(qiáng)的關(guān)聯(lián)，氟氯西林相關(guān)的膽汁淤積性肝炎患者中，HLA-B* 5701攜帶率比普通人群高3倍,而HLA-B* 5701可使患者發(fā)生氟氯西林肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)至少增加80倍[22]。氟氯西林在歐洲國家被廣泛使用，在開始治療的45 d內(nèi)僅有小于1%的患者發(fā)生膽汁淤積型肝損傷，但是導(dǎo)致肝損傷易感性增加的確切機(jī)制還需進(jìn)一步探索。研究表明，HLA-DRB1*1501-DQB1* 0602與阿莫西林-克拉維酸和氟烷等藥物引起的藥物性膽汁淤積強(qiáng)相關(guān)[23]，而HLA-A * 3002 和B*1801則與阿莫西林-克拉維酸引起的肝細(xì)胞損傷型DILI密切相關(guān)[24]。此外，由于HLA多態(tài)性在種族上受到限制，在一個(gè)患者群體中缺乏DILI易感性的遺傳關(guān)聯(lián)并不排除另一組中的正相關(guān)，如HLA易感性等位基因在漢族和歐洲人對(duì)卡馬西平過敏反應(yīng)不同。在未來5～10年中，將使用基因測序完成對(duì)特異質(zhì)性DILI易感性的宿主遺傳多態(tài)性的研究。

越來越多的證據(jù)顯示，DILI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是上述要素互相作用的結(jié)果，而且各機(jī)制之間互為因果。如細(xì)胞應(yīng)激和線粒體損傷可用作觸發(fā)免疫反應(yīng)的危險(xiǎn)因素，先天性免疫參與啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，各種損傷機(jī)制互相關(guān)聯(lián)，最終都導(dǎo)致線粒體損傷。目前了解到的DILI發(fā)病機(jī)制只是九牛一毛，預(yù)防和治療DILI還需要深入了解肝毒性機(jī)制。我們需要從免疫學(xué)和分子生物學(xué)角度更深入地研究DILI發(fā)病靶點(diǎn)。相信在不久的將來，能降低DILI的發(fā)病水平，可以找到預(yù)防、診斷和治療DILI的方法。