林振浩（綜述） 唐敏娜 胡嘉祿 顏 彥（審校）

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科 上海 200032）

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，起始于機(jī)體對(duì)血管內(nèi)皮損傷的反應(yīng)，隨后發(fā)展至血管壁脂質(zhì)沉積和持續(xù)性的炎癥反應(yīng)［1］。基于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的“炎癥”和“脂質(zhì)沉積”學(xué)說(shuō)而開(kāi)發(fā)的抗炎和降脂藥物目前已成為臨床上治療動(dòng)脈粥樣硬化的基石。然而，單純的藥物抗炎和降脂作用越來(lái)越有限，而且一些患者已經(jīng)表現(xiàn)出耐藥性。因此，需要探究動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展更深層次的調(diào)控過(guò)程，從而為臨床提供更加有效的預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的方法。

2000年人類(lèi)基因組計(jì)劃宣布完成，人類(lèi)基因組約30億堿基對(duì)中編碼蛋白質(zhì)的DNA片段所占比例不到5%，非編碼序列占主要成分。2003年啟動(dòng)的DNA元件百科全書(shū)的項(xiàng)目（encyclopedia of DNA elements，ENCODE）用了9年時(shí)間證明，人類(lèi)基因組中約80%的DNA具有功能，非編碼RNA參與的表觀遺傳調(diào)控過(guò)程或許才是導(dǎo)致功能差異的主要變量［2］。表觀遺傳調(diào)控過(guò)程在血脂代謝和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［3］。除了傳統(tǒng)的DNA及組蛋白的甲基化和去甲基化，非編碼RNA，即微小RNA（micro RNA，miRNA）、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、環(huán)狀 RNA（circularRNA，circRNA）等參與的復(fù)雜多變的調(diào)控過(guò)程對(duì)于血脂代謝和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展更為重要［4-7］。這些發(fā)現(xiàn)為降低血脂和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化提供了更加具體的靶點(diǎn)，并為臨床開(kāi)發(fā)新的治療方式提供了理論基礎(chǔ)。

miRNA與血脂代謝miRNA是長(zhǎng)度為18～24個(gè)核苷酸的單鏈RNA片段，物種之間具有高度的保守性，通過(guò)與靶基因mRNA的3′-UTR結(jié)合，阻斷mRNA的轉(zhuǎn)錄或引起mRNA的降解，從而導(dǎo)致蛋白表達(dá)的降低［8-10］。哺乳動(dòng)物體內(nèi)超過(guò)50%的編碼蛋白的基因，其mRNA受miRNA的調(diào)控［11］。miRNA與mRNA之間的特殊作用模式，使得單個(gè)miRNA可以調(diào)控多種蛋白的表達(dá)，而同一種蛋白的表達(dá)也可以受到不同種miRNA的調(diào)控，從而形成miRNA復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miRNA導(dǎo)致蛋白表達(dá)下調(diào)的這種沉默效應(yīng)，使得基于miRNA的治療方法具有巨大的研究?jī)r(jià)值，研究者既可使用miRNA增強(qiáng)劑下調(diào)某種蛋白的表達(dá)，也可使用miRNA拮抗劑上調(diào)某種蛋白的表達(dá)［12］。miRNA在低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDLC）的代謝過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)miRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)LDL受體（LDL receptor，LDLR）、載脂蛋白B（apolipoprotein B，apoB）和前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）的表達(dá)而控制血漿LDL-C水平［13］。通過(guò)miRNA增強(qiáng)劑或拮抗劑對(duì)低密度脂蛋白代謝過(guò)程中的相關(guān)miRNA進(jìn)行調(diào)節(jié)，是一種具有巨大潛力的治療策略。

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究表明，大量miRNA（如miR-27a、miR-27b、miR-130b、miR-148a、miR-185和miR-301b）均可通過(guò)靶向作用于LDLR mRNA的3′-UTR而調(diào)節(jié)LDLR的表達(dá)，其中miR-148a和miR-185已在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)可降低血漿LDL-C水平［14-15］。PCSK9通過(guò)與肝臟上的LDLR結(jié)合，促進(jìn)LDLR降解，從而參與LDL-C代謝，影響血漿LDLC水平，而編碼PCSK9的基因序列發(fā)生變化可使血漿LDL-C呈低濃度水平，并降低冠心病的發(fā)病率［16］。研究發(fā)現(xiàn)miR-224可直接靶向PCSK9 mRNA并顯著下調(diào)其表達(dá)，多種miRNA（如miR-18a-5p、miR-148、miR-323-5P、miR-570、miR-584t、miR-663-b、miR-922、miR-3919、miR-3974、miR-4509、miR-4690-5p、miR-4732-5p、miR-4795-5P、miR-5586-3P和miR-6134等）均被預(yù)測(cè)可與PCSK9 mRNA的3′-UTR結(jié)合，進(jìn)而下調(diào)PCSK9的表達(dá)［17-18］。apoB存在于低密度脂蛋白的表面，細(xì)胞識(shí)別和攝取LDL-C主要通過(guò)識(shí)別apoB實(shí)現(xiàn)，高水平apoB常見(jiàn)于高脂血癥，有研究證實(shí)miR-34a、miR-30c和miR-122參與apoB代謝，可降低血脂水平［19-21］。在血脂代謝方面，大量miRNA可通過(guò)影響LDLR、PCSK9和apoB等蛋白的表達(dá)而影響血脂代謝，這為治療高脂血癥、防止動(dòng)脈粥樣硬化提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

siRNA與血脂代謝除了miRNA通過(guò)作用于靶基因mRNA的3′-UTR而介導(dǎo)的RNA干擾（RNA interfering，RNAi）外，經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的外源siRNA介導(dǎo)的RNAi是一種更為成熟、應(yīng)用更為廣泛的技術(shù)。siRNA是一個(gè)長(zhǎng)度為20～25個(gè)核苷酸的雙鏈RNA，每條鏈各有1個(gè)磷酸化的5′末端和一個(gè)羥基化的3′末端，其中一條稱(chēng)為正義鏈，另一條稱(chēng)為反義鏈。利用一種稱(chēng)為Dicer的酶處理得到此結(jié)構(gòu)，這種酶可以將較長(zhǎng)的雙鏈RNA或短發(fā)卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）切成siRNA。由正義鏈和反義鏈組成的雙鏈siRNA通過(guò)與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）結(jié)合后激活RISC，隨后siRNA的正義鏈被RISC的內(nèi)切酶Argonaute 2（AGO2）切割掉，剩下的反義鏈將活化的RISC引導(dǎo)至靶基因的mRNA，siRNA的反義鏈與靶基因的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，從而特異性介導(dǎo)基因沉默［22］。正是因?yàn)閟iRNA有這種基因沉默作用，有時(shí)候siRNA也被稱(chēng)為沉默RNA（silencing RNA）。

得益于siRNA的特殊作用機(jī)制，通過(guò)將設(shè)計(jì)的外源siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)而獲得某種基因功能缺失的方法已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，而基于siRNA的療法已被證明對(duì)心血管疾病有巨大的治療潛力［23］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，以翻譯apoB的mRNA為靶點(diǎn)的siRNA可明顯降低小鼠和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物血液中LDL-C水平［5］。臨床試驗(yàn)方面，ORION-1研究［24］使用了基于siRNA的PCSK9抑制劑Inclisiran，共納入497例患者，隨機(jī)分配成單次注射治療組（n=251）和雙次注射治療組（n=241），每組再隨機(jī)分為4個(gè)亞組，單次注射治療組分別給予安慰劑或注射Inclisiran 200、300、500 mg，雙次注射治療組分別給予安慰劑或注射Inclisiran 100、200、300 mg。從第一次注射給藥到最后一次隨訪(fǎng)，共計(jì)360天，分別在第14、30、360天進(jìn)行隨訪(fǎng)，在第180天進(jìn)行一次主要評(píng)估，雙次注射治療組在第90天進(jìn)行第二次給藥。結(jié)果顯示：?jiǎn)未巫⑸銲nclisiran 300 mg，第60、180、360天分別觀察到LDL-C下降50.9%、38.6%、19.0%（P均＜0.000 1）。雙次注射Inclisiran 300 mg，第150、180、360天分別觀察到LDL-C下降55.5%、52.5%、31.4%（P均＜0.000 1）。在隨訪(fǎng)的360天內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)安全性問(wèn)題，隨機(jī)藥物組總體不良事件發(fā)生率、瞬時(shí)轉(zhuǎn)氨酶升高的發(fā)生率與安慰劑組類(lèi)似，肌酸激酶、肌酸激酶同工酶升高發(fā)生率亦無(wú)差異。

雖然目前基于siRNA的RNAi技術(shù)還存在脫靶效應(yīng)以及準(zhǔn)確遞送的問(wèn)題［25］，但是動(dòng)物研究和臨床試驗(yàn)都進(jìn)一步證實(shí)該方法降脂的有效性。隨著研究的深入，對(duì)siRNA作用的認(rèn)識(shí)不斷加深，基于siRNA的RNAi技術(shù)可能會(huì)成為臨床上有效預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的一種方法。

lncRNA與血脂代謝lncRNA是一種長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸且不編碼蛋白的RNA，第一個(gè)被報(bào)道發(fā)現(xiàn)的lncRNA是H19，隨后Cell于1992年同期發(fā)表了兩篇文章報(bào)道lncRNA Xist。隨后的十幾年里，miRNA和siRNA一直是非編碼RNA家族里被研究的主角，但lncRNA的研究卻一直呈緩慢進(jìn)展的狀態(tài)，直至2012年ENCODE計(jì)劃完成后，大量lncRNA才陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。miRNA和siRNA最主要的作用機(jī)制是沉默靶基因，比較單一，而lncRNA的作用機(jī)制復(fù)雜多樣，不僅參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，還作為信號(hào)分子參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，作為分子誘餌阻斷某些生物學(xué)過(guò)程，甚至作為分子支架協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)的各種分子間的交互［26］。正是由于lncRNA復(fù)雜多樣的作用機(jī)制，其參與的生物學(xué)過(guò)程更廣泛，lncRNA很有可能會(huì)成為分子生物學(xué)里的支柱型分子之一［27］。

最新研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系：lncRNA MIAT與心肌梗死相關(guān)，而lncRNA LIPCAR與心臟重塑和慢性心力衰竭相關(guān)［28-30］。在心肌梗死患者中，lncRNA aHIF、lncRNA KCNQ1OT1、lncRNA MALAT1表達(dá)增加，而lncRNA ANRIL表達(dá)下調(diào)［31］。在血脂代謝及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展方面，lncRNA也發(fā)揮重要作用：lncRNA lnc肝臟特異性三酰甘油調(diào)節(jié)因子（liver-specific triglyceride regulator，LSTR）與三酰甘油的代謝密切相關(guān)，lncLSTR敲除小鼠血液中三酰甘油水平明顯下降，而載脂蛋白C2（apolipoprotein C2，apoC2）的表達(dá)水平明顯上升，apoC2能夠激活脂蛋白脂酶，進(jìn)而提高血三酰甘油的清除率［32］；lncRNA載脂蛋白A1（apolipo-protein A1，apoa1）-反義轉(zhuǎn)錄物（antisense，AS）是apoa1基因的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，apoa1-AS通過(guò)與apoa1基因結(jié)合抑制其表達(dá)，從而降低外周血apoa1水平［33］；lncRNA DYNLRB2-2能夠通過(guò)胰高血糖素樣肽-1受體（glucagon-like peptide 1 receptor）信號(hào)通路上調(diào)G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor 119，GPR119）及ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)錄子A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）的表達(dá)，其中GPR119的激活能夠抑制來(lái)源于THP-1巨噬細(xì)胞的泡沫細(xì)胞內(nèi)的炎癥，而ABCA1的激活則介導(dǎo)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，即將肝外組織細(xì)胞內(nèi)的膽固醇通過(guò)血液循環(huán)運(yùn)回到肝臟，在肝臟中進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化再排出體外的過(guò)程，DYNLRB2-2通過(guò)上述一系列過(guò)程參與調(diào)控膽固醇代謝及動(dòng)脈粥樣硬化的形成過(guò)程［34］。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA Lexis能夠通過(guò)阻斷轉(zhuǎn)錄激活因子與羥甲基戊二酸單酰輔酶還原酶（HMGCoA reductase，HMGCR）基因的結(jié)合，抑制膽固醇的合成，而HMGCR正是他汀類(lèi)藥物的作用靶點(diǎn)。一項(xiàng)利用Lexis基因治療家族性高膽固醇血癥小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)治療的小鼠患動(dòng)脈粥樣硬化的比例明顯降低［35-36］。肝臟組織高表達(dá)的lncRNA HULC、lnc-HC和脂肪組織高表達(dá)的類(lèi)固醇受體RNA激活因子（steroid receptor RNA activator，SRA）、Blnc1、lnc-BATE1、NEAT-1均與血脂代謝及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展有密切關(guān)系［37］。

得益于高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，lncRNA的研究獲得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)步，隨著越來(lái)越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)，對(duì)其在血脂代謝方面作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)不斷深入，lncRNA有望成為預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的新的作用靶點(diǎn)。

circRNA與血脂代謝circRNA是形成共價(jià)閉環(huán)的單鏈RNA，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且在機(jī)體內(nèi)含量豐富，近年來(lái)由于生化方法的快速進(jìn)步和高通量測(cè)序技術(shù)的使用，越來(lái)越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)和分離出來(lái)，目前已知的circRNA超過(guò)32 000個(gè)［38］。circRNA與機(jī)體的許多生理和病理過(guò)程相關(guān)，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控上發(fā)揮重要作用：circRNA可與一些miRNA結(jié)合，抑制miRNA的功能，該作用被稱(chēng)為miRNA海綿（miRNA sponge）；circRNA可控制mRNA的可變剪切以及親本基因的表達(dá)［39］。許多circRNA都來(lái)自于與心血管疾病相關(guān)的基因，在健康和患病的心臟中存在表達(dá)差異，提示其在疾病的發(fā)展過(guò)程中或許發(fā)揮一定的作用［40-41］。心肌梗死相關(guān)circRNA（myocardial infarction-associated circRNA，MICRA）在心肌梗死患者的外周血樣中下調(diào)，MICRA水平低的患者易出現(xiàn)左心功能不全，在經(jīng)皮介入治療后再灌注時(shí)發(fā)生左心功能不全的風(fēng)險(xiǎn)比較高，這提示外周血MICRA水平可作為心?；颊咦笫夜δ馨l(fā)展不全的預(yù)測(cè)因子［42-43］。在缺氧心肌細(xì)胞和心梗小鼠模型中，circRNA CDR1as表達(dá)上調(diào)，體內(nèi)CDR1as的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)心梗面積增加［44］。在血脂代謝方面，同樣有circRNA的參與，circANRIL與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，主要起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用［7］。研究者使用來(lái)自12例冠心病患者和12例對(duì)照個(gè)體的外周血樣進(jìn)行circRNA微陣列分析，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0082081和hsa_circ_0124644與冠心病中度相關(guān)，而hsa_circ_0113854和hsa-circRNA5974與冠心病弱相關(guān)。hsa_circ_0124644作為冠心病外周血樣品的生物標(biāo)志物時(shí)，靈敏度和特異度分別為86.1%和62.6%［45］。冠心病相關(guān)的circRNA或許在與動(dòng)脈粥樣硬化形成相關(guān)的血脂代謝方面發(fā)揮一定的作用。

雖然目前已知的circRNA比較多，但是對(duì)心血管疾?。ㄌ貏e是與血脂代謝異常和動(dòng)脈粥樣硬化）發(fā)生發(fā)展相關(guān)的circRNA研究還不多，鑒于circRNA特殊的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制，其可能會(huì)成為預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用靶點(diǎn)。

結(jié)語(yǔ)血脂代謝異常是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，人類(lèi)基因組計(jì)劃和ENCODE計(jì)劃的完成使我們從非編碼RNA的角度對(duì)血脂代謝異常有了新的認(rèn)識(shí)，無(wú)論是miRNA、siRNA參與的基因沉默效應(yīng)，還是lncRNA、circRNA參與的多種復(fù)雜調(diào)控過(guò)程，都會(huì)對(duì)血脂代謝產(chǎn)生巨大影響，從而影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。得益于全新的的生化方法和高通量測(cè)序的迅猛發(fā)展，未來(lái)對(duì)于非編碼RNA與血脂代謝的關(guān)系一定會(huì)有全新的認(rèn)識(shí)，從而為臨床預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化、降低冠心病發(fā)病率提供更加安全可靠的方法。