聶海丹，王瑛慧，劉娟，劉穎，喬峰，吳麗更

（1.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓科,天津300070；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院口腔科,北京100050;3.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科,天津300070）

組織蛋白酶K（cathepsin K）是木瓜類半胱氨酸蛋白酶家族的一員，因可以在多個位點裂解膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)，而成為哺乳動物最有效的膠原酶[1-2]。近年來，組織蛋白酶K在口腔頜面部疾病中的作用受到越來越多的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶K在牙本質(zhì)、牙髓、牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體、齦溝液中均有表達(dá)，參與生理和病理條件下的基質(zhì)降解破壞與組織重建改造等重要生物活動[3]。研究證實，組織蛋白酶K與牙本質(zhì)齲病[4]、酸蝕癥、牙周炎[5]、種植體周圍炎、牙本質(zhì)粘接老化的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[6]。

組織蛋白酶K在合成之初以沒有活性的酶原形式存在，其蛋白質(zhì)水解活性受到一系列內(nèi)、外源性環(huán)境因素的調(diào)節(jié)[7]。如Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)不同黏接過程可對半胱氨酸組織蛋白酶的活性產(chǎn)生影響，酸蝕及酸蝕-沖洗黏接法能降低組織蛋白酶K活性，而自酸蝕粘接法則增加其活性?？梢娊M織蛋白酶K是一類在弱酸性環(huán)境中不穩(wěn)定的糖蛋白[9]。

食物是影響口腔環(huán)境的重要因素。研究表明，酸性飲料可以影響唾液、菌斑、牙齒表面、齦溝液的pH值[10]。目前，不同酸性飲料及不同飲料酸對組織蛋白酶K的作用情況，尚未見研究報道。因此，本研究擬比較組織蛋白酶K在可口可樂（含有磷酸）、匯源橙汁（含有檸檬酸）和兩種飲料酸的作用下降解膠原的能力，該研究將有助于進(jìn)一步了解口腔環(huán)境中酸的種類和pH值對組織蛋白酶K降解膠原作用的影響,為下一步以組織蛋白酶K為靶點來預(yù)防和治療口腔疾病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 組織蛋白酶K酶原（ALX-201-239-C010，Enzo Life Sciences）；可口可樂（可口可樂有限公司，北京，中國）、匯源橙汁（匯源果汁集團(tuán)，北京，中國）；蛋白 marker（Fermentas，Thermo Fisher Scientific，Illinois state，USA）；磷酸、檸檬酸、明膠和亮抑酶肽（生工生物工程公司，上海，中國）。

1.2 方法

1.2.1 磷酸溶液的制備 配制10 mol/L的磷酸溶液，取3份，用0.1 mol/L氫氧化鈉分別調(diào)節(jié)至pH 2.5、pH 3.0、pH 3.5,備用。

1.2.2 檸檬酸溶液的制備 用無水檸檬酸配制2%的檸檬酸溶液,取3份，用0.1 mol/L氫氧化鈉分別調(diào)節(jié)至 pH 2.5、pH 3.0、pH 3.5，備用。

1.2.3 酶原溶液的制備 將濃度為150 ng/μL的組織蛋白酶 K酶原用稀釋液（20 mmol/L Tris，pH 7.5，5 mmol/L EGTA，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L β 磷酸甘油，10 mmol/L NaF，1 mmol/L 原釩酸鈉，1%Triton×100，0.1%Tween 20）稀釋至 2 μg/L，備用。

1.2.4 實驗步驟 實驗根據(jù)處理因素不同分為10組：（1）可口可樂組。（2）匯源橙汁組。（3）磷酸（pH 2.5）組。（4）磷酸（pH 3.0）組。（5）磷酸（pH 3.5）組。（6）檸檬酸（pH 2.5）組。（7）檸檬酸（pH 3.0）組。（8）檸檬酸（pH 3.5）組。（9）陰性對照組：處理因素為組織蛋白酶 K 酶原稀釋液（20 mmol/L Tris，pH 7.5，5 mmol/L EGTA，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L β 磷酸甘油，10 mmol/L NaF，1 mmol/L 原釩酸鈉，1%Triton×100，0.1%Tween 20）。（10）陽性對照組：處理因素為組織蛋白酶K的激活劑（100 mmol/L乙酸鈉，10 mmol/L DTT，5 mmol/L EDTA，pH 值 3.9）。依次取上述 10個處理組溶液各15 μL，每組取6份，分別加入15 μL酶原溶液（2 μg/L），混合均勻，于37℃水浴箱中孵育5～10 min。

1.2.5 明膠酶譜法檢測CK的活性 分別取5 μL上述孵育后的各組樣品，在含有0.2%明膠底物的12.5%SDS-PAGE上于4℃、100 V的條件下電泳，直至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的邊緣。將凝膠取出，經(jīng)震蕩洗脫（65 mmol/L Tris，20%甘油，pH 7.4，30 min），震蕩水洗10 min，漂洗（10 mmol/L磷酸鈉，0.1 mmol/L EDTA，0.2 mmol/L DTT，pH 6.0，30 min）， 孵 育（37℃，23 h），洗滌（10 min），0.2%考馬斯亮藍(lán)染色1 h，然后用脫色液脫色至清晰條帶出現(xiàn)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用ChemiDoc XRS+成像器（伯樂，加利福尼亞州，美國）采集明膠酶譜法所得電泳條帶圖，用“Quantity One”泳道/條帶軌跡定量法（Trace Tracking）對所得條帶進(jìn)行光密度分析，以每個實驗組6個樣本所測得的光密度的平均值代表各實驗組膠原降解量的多少，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）將兩個飲料組膠原降解量與陰性對照組和陽性對照組進(jìn)行比較分析。通過單變量多因素方差分析（UNIANOVA）對不同pH的磷酸組和不同pH的檸檬酸組的膠原降解量進(jìn)行比較分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 可口可樂和匯源橙汁對組織蛋白酶 K活性的影響 與陰性對照組相比，可口可樂處理組膠原降解量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.49，P＜0.05）。以陽性對照組膠原降解量作為酶活性的參考（100%），可口可樂處理組組織蛋白酶 K的相對酶活性為45%；與陰性對照組相比，匯源橙汁處理組的膠原降解量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=18.98，P＜0.05）。匯源橙汁處理組的相對酶活性為83%?？煽诳蓸诽幚斫M膠原降解量與匯源橙汁處理組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.37，P＜0.05）（圖 1）。

2.2 磷酸對組織蛋白酶 K活性的影響 不同pH（2.5～3.5）的磷酸對組織蛋白酶K總體呈激活作用，在磷酸作用下，組織蛋白酶K的相對酶活性為38%～56%。且隨著磷酸溶液pH的升高，組織蛋白酶K的酶活性逐漸加強(qiáng)（t=5.69、5.21，均P＜0.05，圖 2）。

2.3 檸檬酸對組織蛋白酶 K活性的影響 不同pH（2.5～3.5）的檸檬酸對組織蛋白酶K總體呈激活作用，在檸檬酸作用下，組織蛋白酶K的相對酶活性在41%～125%。且隨著檸檬酸溶液pH值的升高，組織蛋白酶 K的酶活性逐漸減弱（t=4.98、20.47，均P＜0.05，圖 3）。

3 討論

可口可樂和匯源橙汁是目前飲料市場份額占比較高的飲料，這兩種飲料由于對牙齒硬組織的化學(xué)酸蝕和破壞潛力非常強(qiáng)而被定義為具有極度酸蝕能力的飲料[11-12]。在口腔中除牙體硬組織外，組織蛋白酶的活性也易受到酸性環(huán)境的影響[13]。本實驗應(yīng)用明膠酶譜法對可口可樂和匯源橙汁及其所含飲料酸對組織蛋白酶K活性的影響進(jìn)行了觀察。

研究結(jié)果顯示，組織蛋白酶K在有可口可樂或匯源橙汁存在的條件下酶活性增加，降解膠原的量顯著增加。說明可口可樂或匯源橙汁能夠激活無活性的組織蛋白酶K酶原，產(chǎn)生具有活性的組織蛋白酶K。組織蛋白酶K作為一種蛋白水解酶，其主要底物是I型膠原[14]。Ⅰ型膠原纖維是牙本質(zhì)有機(jī)基質(zhì)和骨基質(zhì)的主要成分。組織蛋白酶K通過降解Ⅰ型膠原纖維，在骨基質(zhì)和牙本質(zhì)基質(zhì)破壞和改建中發(fā)揮重要作用。已有的研究證實，齦溝液中組織蛋白酶K活性的升高與牙槽骨吸收顯著相關(guān)[15]；并且組織蛋白酶K活性的升高與種植體周圍炎的骨吸收也密切相關(guān)[16]。提示攝入可口可樂或匯源橙汁會造成口腔環(huán)境中組織蛋白酶K活性的顯著升高，可能加速牙周炎和種植體周圍炎時牙周組織及骨組織的破壞。

本研究結(jié)果顯示，匯源橙汁對組織蛋白酶K的激活能力顯著高于可口可樂，是可口可樂的1.8倍。以pH值表示的H+濃度和飲料酸的緩沖性是決定酸性飲料酸蝕性的主要因素。本實驗中可口可樂是含有磷酸的飲料，pH值為2.5；匯源橙汁是含有檸檬酸的飲料，pH值為3.5。磷酸和檸檬酸均屬于三元酸，但是檸檬酸為有機(jī)酸，緩沖作用很強(qiáng)，有研究顯示使橙汁飲料pH值達(dá)到5.5～7.0所需堿的量是使可口可樂pH值達(dá)到5.5～7.0所需堿量的2倍[10]。由于緩沖作用強(qiáng)，匯源橙汁可以使自身pH值在較長時間內(nèi)維持在較低的水平，這可能是匯源橙汁對組織蛋白酶K的激活作用顯著高于可口可樂的原因。

Avanija等[11]對380種飲料的pH值進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，93%飲料的pH值在4.0以下，磷酸和檸檬酸是大多數(shù)酸性飲料中加入的酸性成分，在酸性飲料的酸蝕特性中扮有重要角色。因此本研究評價了pH值（2.5～3.5）檸檬酸溶液和磷酸溶液對組織蛋白酶K活性的影響。

（1）檸檬酸溶液對組織蛋白酶K活性的影響：實驗結(jié)果顯示，pH值分別為2.5、3.0、3.5的3種檸檬酸溶液對組織蛋白酶K均有激活作用，組織蛋白酶K的活性隨檸檬酸溶液pH值的升高呈下降趨勢，組織蛋白酶K在檸檬酸溶液pH=2.5時顯示了最高的酶活性，相對酶活性達(dá)到125%。由此推測，攝入pH值（2.5～3.0）較低的檸檬酸飲料或食物，如檸檬汁等，會使暴露于口腔不同組織中組織蛋白酶K活性極度增加，對暴露的膠原纖維有強(qiáng)大的破壞作用。這種破壞作用隨檸檬酸在口腔中清除和唾液的緩沖逐漸減弱。

（2）磷酸溶液對組織蛋白酶K活性的影響：本實驗結(jié)果顯示，pH值分別為2.5、3.0、3.5的3種磷酸溶液對組織蛋白酶K均有激活作用，組織蛋白酶K的活性隨磷酸溶液pH值的升高酶活性逐漸加強(qiáng)。在pH3.0和pH3.5時，磷酸和檸檬酸對組織蛋白酶K的作用相當(dāng)。研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶K在環(huán)境pH值為4.0～5.5時，隨著環(huán)境pH值的上升，酶的活性逐漸增強(qiáng)，其發(fā)揮活性的最佳pH值為5.5[17-18]。因此，推測在攝入含有磷酸的飲料后，口腔環(huán)境pH值迅速降低，會使暴露于口腔不同組織中組織蛋白酶K活性增加，并發(fā)揮降解膠原基質(zhì)的作用。伴隨唾液的緩沖作用，口腔環(huán)境中pH值逐漸升高，組織蛋白酶K活性會更強(qiáng)，直到口腔環(huán)境pH恢復(fù)至5.5以上時，組織蛋白酶對膠原的破壞作用才逐漸減弱。

綜上所述，可口可樂和匯源橙汁及其所含的飲料酸均能使組織蛋白酶K活性增強(qiáng)，pH＜3.0的檸檬酸對組織蛋白酶K活性的增強(qiáng)作用尤為顯著。因此，攝入酸蝕性強(qiáng)的飲料尤其是含有檸檬酸的飲料，可能促進(jìn)組織蛋白酶K介導(dǎo)的牙本質(zhì)及牙周組織膠原纖維降解，加速齲病、牙周炎、種植體周圍炎的進(jìn)展。