閆劉慧，王小鵬，金庭飛，劉作文，劉力

（1.廣東益可維健康科技有限公司，廣州 510663；2.河南花花牛乳業(yè)集團(tuán)股份有限公司，鄭州 450000；3.福成五豐食品股份有限公司，廊坊 065200；4.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083）

氧化損傷因機(jī)體參與氧化應(yīng)激而導(dǎo)致多種慢性系統(tǒng)疾病，也體現(xiàn)了機(jī)體衰老發(fā)生與發(fā)展的基礎(chǔ)病理代謝過(guò)程[1,2]，這種代謝過(guò)程進(jìn)一步會(huì)誘發(fā)炎癥、癌癥、阿爾茲海默癥、心腦血管疾病、肺部疾病、肝臟疾病等慢性疾病，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞、組織乃至器官不可逆性的衰老[3～7]，導(dǎo)致機(jī)體損傷。當(dāng)機(jī)體的活性氧（reactive oxygen species，ROS）與自由基的生成能力超過(guò)清除能力時(shí)，活性氧與自由基積累會(huì)使得機(jī)體氧化還原系統(tǒng)的平衡被打破，對(duì)機(jī)體造成不可逆影響。丙二醛（MDA）是膜脂過(guò)氧化產(chǎn)生的，MDA在細(xì)胞內(nèi)積累會(huì)造成一定的氧化損傷，破壞機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等[8,9]。因此，抗氧化系統(tǒng)對(duì)于抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、降低氧化損傷、維持氧化還原平衡具有重要作用[10]。抗氧化系統(tǒng)主要包括兩種氧化劑——酶類抗氧化劑和非酶類抗氧化劑，測(cè)定抗氧化劑的抗氧化水平可通過(guò)測(cè)定總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）進(jìn)行[9]。其中，酶類抗氧化劑主要是催化體內(nèi)氧化酶的毒性產(chǎn)物H2O2的分解[11]，主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、巰基依賴型抗氧化系統(tǒng)（如：谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GSH-Px）等[12]；非酶類抗氧化劑主要包括水溶性抗氧化劑（如：維生素C、硫辛酸LA、尿酸UA）和脂溶性抗氧化劑（如：維生素A、維生素E、輔酶Q10、蝦青素）[13～15]。目前抗氧化活性評(píng)價(jià)方法有四類：體外化學(xué)方法模擬法（如：清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、螯合金屬離子等），優(yōu)點(diǎn)是方便且快速，缺點(diǎn)是外界環(huán)境因素干擾較大[16,17]；抗氧化活性細(xì)胞模型法（如：人源或動(dòng)物源細(xì)胞系的抗氧化細(xì)胞模型），優(yōu)點(diǎn)是相對(duì)精準(zhǔn)，缺點(diǎn)是未考慮體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，因此只能作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)前的預(yù)判斷[18]；抗氧化活性體內(nèi)研究法（如：動(dòng)物氧化模型），優(yōu)點(diǎn)是能直接且清晰判斷抗氧化能力，缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)、成本高[19]；抗氧化活性分子生物學(xué)研究法，可以深入探究起氧化作用的具體生物活性物質(zhì)[20]。近幾年關(guān)于腸道微生態(tài)的研究日益增多，益生菌對(duì)于機(jī)體抗氧化作用也日益突出，其機(jī)制主要從三方面考慮：促進(jìn)ROS清除、提高抗氧化酶活性、保護(hù)DNA免受氧化損傷[21～24]。本試驗(yàn)通過(guò)抗氧化活性體內(nèi)研究法，建立小鼠氧化損傷模型，探究一株植物乳桿菌抗氧化作用的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)菌株：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarumFEED8，保藏編號(hào)為CGMCC No.15029 )，分離自廣西巴馬長(zhǎng)壽老人腸道；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：KM雄性小鼠，SPF級(jí)，2月齡，18～22g（廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；無(wú)乳桿菌小鼠飼料（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼喂前經(jīng)輻射滅菌）；D-半乳糖（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）；GSH-Px 試劑盒、SOD試劑盒、T-AOC試劑盒、MDA試劑盒，蛋白定量測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋（型號(hào)GI54DWS，zealway公司）；多功能生化培養(yǎng)箱（型號(hào)ZSD-1160，TOKYO RIKAKIKAI CO.LTD）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)DHG-9076A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；低溫高速離心機(jī)（型號(hào)3K30，德國(guó)Satorious公司）；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（型號(hào)UV-2800，尤尼柯（上海）儀器有限公司）；勻漿器（德國(guó)普魯克公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物乳桿菌活菌體菌懸液的制備

將植物乳桿菌按照107CFU/mL的接種量分別接種于500mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)18h，4 500g離心15min收集菌體，菌體沉淀重懸于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%（w/v）的脫脂乳中，分別配制成2×106CFU/mL的低劑量菌懸液、2×108CFU/mL的中劑量菌懸液、2×1010CFU/mL的高劑量菌懸液。

D-半乳糖溶液：D-半乳糖以滅菌生理鹽水配制成60mg/mL溶液，使用前用0.22微孔濾膜過(guò)濾除菌。

1.3.2 試驗(yàn)分組

50只小鼠適應(yīng)一周后，隨機(jī)分組，每組10只。分組編號(hào)、組別、處理方式見(jiàn)表1。期間每3d稱重1次，調(diào)整灌胃量，連續(xù)灌服45d，灌胃量為0.1mL/kg/d。試驗(yàn)期間小鼠自由飲食，12h燈照/黑暗循環(huán)。

表1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組情況（n=10）

1.3.3 檢測(cè)指標(biāo)處理

取上述步驟中連續(xù)給予樣品45d的實(shí)驗(yàn)小鼠，于末次灌胃后稱重，并禁食12h，眼球取血并用頸椎脫臼法處死小鼠。肝素鈉抗凝管收集血液，3 000g離心10min，上清液0℃低溫保藏備用。解剖小鼠，取出腦和肝臟，分別稱取0.1～0.2g腦和肝臟組織，加入9倍體積的生理鹽水，于勻漿器中制成10%的組織勻漿液，3 000g離心10min，分別取上清液0℃低溫保藏備用。通過(guò)生化試劑盒分別測(cè)GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量、MDA含量和蛋白含量。各測(cè)試方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS22.0進(jìn)行單因素方差分析，應(yīng)用Duncans法進(jìn)行多重比較，通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平均設(shè)定為P〈0.05。各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)前后各組小鼠體重變化

試驗(yàn)前后對(duì)各組小鼠進(jìn)行體重測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。各組小鼠體重均有所增加。與C2組相比，C1組小鼠增重明顯放緩，說(shuō)明造模成功，造模對(duì)小鼠生長(zhǎng)有不利影響；與C1組相比，L、M、H組小鼠體重均增加，且M、H組增重較C1組有顯著性，說(shuō)明植物乳桿菌FEED8中高劑量對(duì)小鼠生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用；L、M、H組比較，小鼠增重隨FEED8濃度增加而增大，說(shuō)明該菌株在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)小鼠增重與濃度呈正相關(guān)。

圖1 試驗(yàn)前后各組別小鼠體重變化對(duì)比

2.2 植物乳桿菌FEED8對(duì)小鼠血清指標(biāo)的影響

植物乳桿菌FEED8對(duì)小鼠血清GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量、MDA含量的影響如圖2所示。與C2相比，C1小鼠血清中的GSH-Px活力、SOD的活力、T-AOC含量顯著降低，而MDA含量顯著升高，說(shuō)明衰老小鼠造模成功。與C1相比，L、M、H小鼠血清GSH-Px活力、SOD活力，T-AOC含量升高，MDA含量降低，除SOD活力外，M、H組差異顯著，說(shuō)明植物乳桿菌FEED8對(duì)小鼠血清具有抗氧化效果，且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)抗氧化效果隨濃度升高而增強(qiáng)。

圖2 不同組別小鼠血清抗氧化指標(biāo)對(duì)比

2.3 植物乳桿菌FEED8對(duì)小鼠腦指標(biāo)的影響

植物乳桿菌FEED8對(duì)小鼠腦GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量、MDA含量的影響如圖3所示。與C2組相比，C1組小鼠腦中的GSH-Px和SOD活力、T-AOC含量均顯著降低，而MDA含量顯著升高，說(shuō)明衰老小鼠造模成功。與C1相比，M、H組小鼠腦GSH-Px活力、SOD活力顯著提升，L、M、H組小鼠腦T-AOC含量均顯著提升，且M、H組小鼠腦MDA含量顯著降低，說(shuō)明植物乳桿菌FEED8對(duì)小鼠腦具有抗氧化效果，且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)抗氧化效果隨濃度升高而增強(qiáng)。

圖3 不同組別小鼠腦抗氧化指標(biāo)對(duì)比

2.4 植物乳桿菌FEED8對(duì)小鼠肝臟指標(biāo)的影響

植物乳桿菌FEED8對(duì)小鼠肝臟GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量、MDA含量的影響如圖4所示。與C2組相比，C1組小鼠肝臟中的GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量均顯著降低，而MDA含量顯著升高，說(shuō)明衰老小鼠造模成功。與C1組相比，M、H組小鼠肝臟GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量顯著提高，且H組MDA含量明顯降低，說(shuō)明植物乳桿菌FEED8對(duì)小鼠肝臟具有抗氧化效果，且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)抗氧化效果隨濃度升高而增強(qiáng)。

圖4 不同組別小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)對(duì)比

3 結(jié)論

植物乳桿菌FEED8對(duì)D-半乳糖致衰小鼠抗氧化系統(tǒng)的試驗(yàn)表明，與模型組相比，灌胃該菌組小鼠血清、腦、肝臟中SOD活性、GSH-Px活性和T-AOC含量均有升高，MDA含量均有降低，且FEED8中高劑量組數(shù)據(jù)與模型組相比大多差異顯著，三個(gè)組織試驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明植物乳桿菌FEED8具有抗氧化能力，且隨濃度增加抗氧化能力增強(qiáng)。植物乳桿菌FEED8的抗氧化作用，可能與腸道菌群通過(guò)參與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、代謝作用等多種途徑[25]影響機(jī)體對(duì)氧化損傷和組織修復(fù)能力有關(guān)，其機(jī)理仍需進(jìn)一步探究。