劉世明 王如意 路 霖 李愈嫻 李 媛 徐效龍 潘 虹 李騰龑 王彬彬 陳秋紅*

1.青海省心腦血管病專科醫(yī)院(西寧，810000)：2.國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所；3.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院

中國(guó)現(xiàn)有先天性心臟病(CHD)患者200萬人[1]，患病率1‰～7‰。《中國(guó)心血管病報(bào)告2011》[2]指出，患病率與當(dāng)?shù)睾０魏铜h(huán)境因素有關(guān)。一項(xiàng)對(duì)青海省不同海拔地區(qū)的4～18歲兒童CHD患病率調(diào)查[3]顯示，標(biāo)準(zhǔn)化后，海拔2000米以上(4.79‰)、3000米以上(5.78‰)、4000米以上(8.84‰)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且相同地區(qū)不同民族患病率也有很大不同。推測(cè)在高原低氧環(huán)境中，遺傳因素可能發(fā)揮了重要的作用。越來越多的證據(jù)表明組蛋白乙?；疆惓Ｅc心臟發(fā)育異常相關(guān)[4]，但CHD發(fā)生的表觀遺傳學(xué)相關(guān)研究很少，特別是去乙?；秆芯慷嗉性贗類和II類，關(guān)于III類研究極少。Sir2相關(guān)酶類是III類去乙?；?，SIRT1-SIRT7是人類Sirtuin家族的7個(gè)成員。近年研究發(fā)現(xiàn)SIRT家族成員在低氧誘導(dǎo)信號(hào)通路[5-7]和心臟組織發(fā)育[8-9]的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。SIRT7基因是Sirtuin家族的重要成員，可通過催化活性和非催化活性調(diào)控低氧誘導(dǎo)信號(hào)通路和心臟發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而在低氧適應(yīng)[10-11]和心臟發(fā)育[9]等方面發(fā)揮重要作用；可能參與心臟組織發(fā)育的調(diào)控。SIRT7突變的心臟中活化的Akt含量大幅增加[12]，Akt信號(hào)通路對(duì)心肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期有重要影響[13]。因此，本研究通過對(duì)青海高原地區(qū)藏族CHD患者進(jìn)行SIRT7基因突變篩查和識(shí)別潛在致病突變，研究SIRT7基因變異與高原地區(qū)藏族先天性心臟病的發(fā)生關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集青海地區(qū)254例藏族散發(fā)CHD患者為病例組，288例藏族非先心病健康個(gè)體作為對(duì)照組。本研究通過青海省心腦血管病專科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并且獲得了所有個(gè)體或其監(jiān)護(hù)人的知情同意。

1.2 Sanger測(cè)序

采集研究對(duì)象外周血抗凝，應(yīng)用QIAGEN試劑盒提取DNA，-20℃保存。用Primer 5.0設(shè)計(jì)了5對(duì)特異性引物(表1)，對(duì)SIRT7基因的外顯子區(qū)及周圍序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR儀型號(hào)S1000TM Thermal Cycler。將兩組PCR產(chǎn)物送華大基因公司Sanger測(cè)序。

表1 SIRT7基因外顯子區(qū)引物

1.3 在線網(wǎng)站分析

對(duì)檢測(cè)出的變異位點(diǎn)進(jìn)行在線分析，在NCBI dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)、1000Genomes 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://browser.1000genomes.org/)、ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)(http://exac.broadinstitute.org/)和gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gnomad-old.broadinstitute.org/)中進(jìn)行變異位點(diǎn)頻率檢索，用Mutationtaster在線預(yù)測(cè)變異蛋白的有害性。用CLC Sequence Viewer 8軟件對(duì)SIRT7蛋白進(jìn)行保守性分析。

2 結(jié)果

2.1 納入樣本基本特征

病例組254例中，有128例房間隔缺損(ASD)，39例室間隔缺損(VSD)，58例動(dòng)脈導(dǎo)管未閉(PDA)，2例ASD、VSD聯(lián)發(fā)，5例PDA、VSD聯(lián)發(fā)，2例ASD、PDA聯(lián)發(fā)，20例不常見的復(fù)雜先心病。

2.2 突變篩查

通過突變篩查，在一例藏族女性ASD患者中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的SIRT7基因錯(cuò)義突變(NM_016538.3: c.C181G;p.Leu61Val)，如圖1-A(見插頁(yè))。突變使得SIRT7編碼鏈的第181位堿基由C變成G，導(dǎo)致編碼的肽鏈的第61位氨基酸由亮氨酸變成纈氨酸。對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)該錯(cuò)義突變。

2.3 在線網(wǎng)站分析

在NCBI dbSNP、1000Genomes、ExAD和gnomeAD數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行變異位點(diǎn)頻率檢索，該突變?cè)?個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均沒有出現(xiàn)，表明該突變是新突變。用Mutationtaster在線預(yù)測(cè)變異蛋白的有害性，預(yù)測(cè)結(jié)果為disease-causing。用CLC Sequence Viewer 8軟件在多個(gè)物種間對(duì)SIRT7蛋白進(jìn)行保守性分析。從圖1-B(見插頁(yè))可以看出，這一位點(diǎn)具有很強(qiáng)的進(jìn)化保守性。

3 討論

Sirtuins是在進(jìn)化上保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性的III類組蛋白去乙?；竅14]。SIRT家族成員在低氧誘導(dǎo)信號(hào)通路[5-7]和心臟組織發(fā)育[8-9]的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。SIRT7基因位于人染色體的17q25，有10個(gè)外顯子。與Sirtuins的其他家族成員一樣具有保守的催化NAD+結(jié)合域和獨(dú)特的N-和C-端區(qū)域，分別包含核和核仁定位信號(hào)[16]。有數(shù)據(jù)表明SIRT7的N區(qū)和C區(qū)都有助于SIRT7的可溶性表達(dá)[16]。而蛋白質(zhì)只有溶于溶劑中才能發(fā)揮催化功效。據(jù)報(bào)道，激活SIRT7的去乙?；拿富钚约刃枰狽端區(qū)域也需要C端區(qū)域[17]。SIRT7多肽鏈上N區(qū)的位于α1的第29位亮氨酸Leu、32位纈氨酸Val、36位亮氨酸Leu、35位的異亮氨酸Ile，位于α2的第50位和51位的亮氨酸Leu，位于α3的第57位亮氨酸、58位纈氨酸Val、61位亮氨酸Leu的這些殘基形成一個(gè)小的富含亮氨酸的疏水核[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)的突變就是61位的亮氨酸(位于第3個(gè)外顯子上)變?yōu)榱死i氨酸，這可能對(duì)于疏水核結(jié)構(gòu)和功能有一定影響。在數(shù)據(jù)庫(kù)中變異位點(diǎn)頻率檢索，該突變均未有出現(xiàn)，證明這個(gè)位點(diǎn)的罕見性。用Mutationtaster在線預(yù)測(cè)變異蛋白的有害性為disease causing，這也為研究提供了佐證。該位點(diǎn)在多個(gè)物種間具有高度保守性，本研究只在病例組中發(fā)現(xiàn)了該突變，而在對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)，我們推測(cè)這個(gè)變異可能導(dǎo)致了患者發(fā)病。

SIRT7在低氧誘導(dǎo)信號(hào)通路調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。低氧誘導(dǎo)因子(HIF)1和HIF2是異二聚體蛋白由受氧調(diào)節(jié)的HIF-1α或HIF-2α亞基和組成型表達(dá)的HIF-1β亞基組成，介導(dǎo)對(duì)低氧的適應(yīng)性轉(zhuǎn)錄應(yīng)答[19]。其中HIF-1是調(diào)節(jié)生理病理狀態(tài)下氧平衡的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在低氧下能激活多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，如促紅細(xì)胞生成素(EPO), 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，烯醇化酶1(ENO1)等，這些靶基因參與氧氣運(yùn)輸、血管生長(zhǎng)和糖代謝等重要的生理病理過程[19]。Hubbi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT7是低氧信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，可以抑制低氧誘導(dǎo)因子HIF的活性，直接與HIF-1α和HIF-2α蛋白質(zhì)相互作用，抑制HIF-1α和HIF-2α轉(zhuǎn)錄活性及蛋白表達(dá)。而體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，組蛋白去乙酰化酶抑制可以降低HIF-1α和VEGF的表達(dá)，說明它們受到組蛋白乙?；揎椪{(diào)控[20]。因此我們認(rèn)為SIRT7的突變(NM_016538.3: c.C181G;p.Leu61Val)可能導(dǎo)致突變的蛋白去乙酰化酶活性受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致HIF-1α和VEGF表達(dá)下降，導(dǎo)致在低氧狀態(tài)下心臟發(fā)病。

SIRT7可能參與在心臟組織發(fā)育的調(diào)控。SIRT7突變的心臟中，總體Akt 蛋白水平稍微的增加，但是活化的Akt含量卻大幅增加[12]，Akt信號(hào)通路調(diào)控心肌細(xì)胞存活和凋亡，介導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大及Akt的活化不僅可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的肥大，還能增強(qiáng)小鼠心肌收縮力，對(duì)心肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期有重要影響[13]。Vakhrusheva等[9]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT7能導(dǎo)致p53去乙?；cSIRT7缺陷小鼠p53過乙?；托募〖?xì)胞凋亡增加的結(jié)論一致。因此本研究發(fā)現(xiàn)的這個(gè)突變也可能通過導(dǎo)致活化的Akt含量增加、p53去乙?；剐募〖?xì)胞肥大，進(jìn)而導(dǎo)致疾病發(fā)生，但還需進(jìn)一步功能試驗(yàn)來驗(yàn)證此觀點(diǎn)。

綜上所述，本研究通過Sanger測(cè)序在青海高原的藏族先心病患者中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的SIRT7錯(cuò)義突變(NM_016538.3: c.C181G;p.Leu61Val)，表明SIRT7可能與中國(guó)西部高原地區(qū)藏族的先心病發(fā)生有關(guān)。SIRT7的突變可能導(dǎo)致機(jī)體在低氧適應(yīng)[10-11]和心臟發(fā)育等方面發(fā)生改變，導(dǎo)致先心病發(fā)生。本研究為進(jìn)一步理解高原地區(qū)藏族先心病的發(fā)生機(jī)制提供基礎(chǔ)。