李超強(qiáng) 朱凱欣 馮蘭青 蔡 冠 麥海珠 吳亞敏 伍春蓉

中山大學(xué)附屬東華醫(yī)院(東莞，523110)

精子凍融技術(shù)在人類輔助生殖技術(shù)中已得到廣泛應(yīng)用，而微量精子冷凍技術(shù)的進(jìn)步，使許多嚴(yán)重少弱精子癥、梗阻性無精子癥等患者的微量精子得到有效凍存，確保了取卵日有足夠使用的精子[1]。但對非梗阻性無精癥或隱匿性精子癥患者，每次取精可獲得活動精子極其稀少或無，往往導(dǎo)致取卵日卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(ICSI)時精子數(shù)量不夠或沒有，周期取消率高，給治療帶來巨大壓力。目前存在：稀少精子冷凍或冷凍液量大，解凍后找精子困難且耗時長，精子回收率和存活率低；或開放式載體，交叉污染風(fēng)險大；或凍融操作或ICSI使用時復(fù)雜等[2-4]，無法滿足臨床需求。尋找稀少精子回收率、存活率高且操作簡單的冷凍載體及方法是關(guān)鍵。本文對新型超微量冷凍載體和麥管進(jìn)行稀少精子凍融研究，探討其臨床價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2018年6-12月本院生殖醫(yī)學(xué)科，因男方嚴(yán)重少弱精子癥在取卵日行ICSI治療且女方有不成熟卵子的患者共30例。納入標(biāo)準(zhǔn)：女方采用長方案促排卵，取卵日至少有未成熟卵子；男方禁欲3～5d，精子濃度<5×106/ml，前向運(yùn)動精子<10%，手淫法取精后洗滌法處理精子。女方年齡30.8±4.1歲，男方年齡33.4±5.5歲。所有研究患者均知情同意，研究獲本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

分別采用新型超微量冷凍載體(新型組)和超微量冷凍麥管(麥管組)做載體，再根據(jù)冷凍體積將新型組分為0.5μl組、1μl組和2μl組，麥管組分為5μl組、10μl組。根據(jù)ICSI精子來源分為新鮮精子組和冷凍精子組。

1.3 冷凍載體

新型超微量冷凍載體由25μl旋蓋式超微量冷凍載體(上海辛菖)和1.8ml精子冷凍管(NUNC)組成。超微量冷凍麥管為50μl超微量冷凍麥管(TLD)。

1.4 稀少精子凍融

1.4.1新型超微量冷凍載體在穿刺皿(BDFalon 1006)中用G-Mops plus做10μl長條液滴，吸精子冷凍液于冷凍薄片載體小黑圈內(nèi)，蓋礦物油，吸取2μl精子懸液于G-Mops plus液滴中，用顯微操作儀注射針吸10條活動精子于精子冷凍液中，用無菌鑷子取出冷凍載體并除去載體上多余的礦物油，裝入精子凍存管并擰緊螺帽，于液氮面上5cm蒸10min，1cm蒸5min后投入液氮中凍存。受精日把精子冷凍管從液氮中取出，將超微量冷凍薄片載體置于37℃礦物油中復(fù)蘇后置穿刺皿中，孵育30min后計數(shù)回收精子數(shù)量和活動精子數(shù)量。

1.4.2超微量冷凍麥管載體在穿刺皿中做10μl長G-Mops plus液滴和冷凍液滴，蓋礦物油，吸2μl精子懸液于G-Mops plus液滴中，用顯微操作系統(tǒng)注射針吸取10條活動精子于冷凍液滴中，用冷凍麥管吸精子冷凍液，封好麥管兩端，置液氮面上5cm蒸10min，1cm蒸5min后投入液氮中凍存。解凍日將冷凍麥管從液氮中取出 37℃水浴1min，用干凈紗布擦去麥管上水，將麥管中精子懸液吹入培養(yǎng)皿中，蓋上礦物油37℃孵育30min，計數(shù)回收精子數(shù)和活動精子數(shù)。

1.4.3精子存活判斷用顯微操作儀的注射針將復(fù)蘇后精子移到低滲腫脹液滴中，依據(jù)WHO《第五版人類精液檢查和處理實(shí)驗(yàn)室手冊》標(biāo)準(zhǔn)判斷。

1.5 凍融精子授精

對采卵日ICSI周期獲得廢棄的不成熟卵子移至G-IVF plus液中培養(yǎng)，次日若有第一極體排出卵子，則解凍新型超微量冷凍載體凍存的精子并挑選存活精子進(jìn)行ICSI授精，授精后17±1h評估受精情況，44±1h評估卵裂情況，計算受精卵數(shù)和卵裂數(shù)。

1.6 指標(biāo)評估

回收率=回收精子數(shù)/冷凍精子數(shù)；活動率=(前向運(yùn)動+非前向運(yùn)動)級精子數(shù)/回收精子數(shù)，存活率=尾部卷曲的精子數(shù)/回收精子數(shù)；受精率=(1pn+2pn+多pn)卵子數(shù)/注射成熟卵子數(shù)；卵裂率=受精卵裂數(shù)/受精卵數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)

采用SPSS20.0處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料用(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 稀少精子冷凍結(jié)局

兩組不同體積冷凍液滴解凍后精子回收率、活動率、及存活率比較均無差異(P>0.05)，但新型組2μl精子回收率、存活率高于麥管組的5μl(P<0.001)。見表1。

表1 兩種載體組不同冷凍體積稀少精子凍融結(jié)果比較[%(條)]

2.2 新型組受精及卵裂情況

新型組中，新鮮精子ICSI的受精率和卵裂率與冷凍精子組無差異(P>0.05)，見表2。

表2 新型組不同精子受精及卵裂情況[%(個)]

3 討論

研究表明[5]，非梗阻性無精子癥在男性不育患者中占15%，生精功能嚴(yán)重低下，睪丸組織細(xì)針穿刺術(shù)往往取精失敗，通常需采用顯微外科取精術(shù)才可能找到精子。隱匿性精子癥患者精液常需要離心后才可能找到數(shù)量不多的精子。這兩類患者一次性排精或手術(shù)能找到的活動精子數(shù)量極度稀少，且精子胞膜、核DNA穩(wěn)定性差。凍融過程的溫度和滲透壓激烈變化以及冰晶的形成均會造成精子細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架、DNA和活動力等不同程度損傷，導(dǎo)致精子凍融效果十分不理想[6-8]。如何簡單有效的凍融人類稀少精子成為臨床胚胎學(xué)關(guān)注焦點(diǎn)。

現(xiàn)有文獻(xiàn)顯示稀少精子冷凍載體主要有空透明帶法、空膠囊法、冷凍環(huán)法、微滴冷凍法和Sperm等[2-4,9]。這些載體精子凍融后精子回收率、存活率差異大[10]，且存在各自弊端?？胀该鲙Хú捎萌嗽椿蚍侨嗽赐该鲙?，無法避免外來異源性蛋白污染，帶來一系列生物學(xué)和倫理學(xué)難題；冷凍環(huán)法的精子冷凍液滴開放地承載于環(huán)膜上，安全性差且操作要求高；空膠囊法的膠囊制備操作復(fù)雜，難以常規(guī)應(yīng)用于臨床；微滴冷凍法，交叉污染風(fēng)險大，安全隱患高。

旋蓋式超微量冷凍載體是一種可用于微量精子冷凍的新型載體。本研究采用旋蓋式超微量冷凍載體中的冷凍薄片和1.8ml凍存管組合成新型超微量冷凍載體，進(jìn)行稀少精子快速冷凍和原位解凍獲得了較高的精子回收率，而超微量冷凍麥管法精子回收率低。新型超微量冷凍載體法由于原位冷凍和解凍，微滴小且有黑圈標(biāo)識，顯微鏡下容易識別精子冷凍滴，易找到精子；而超微量冷凍麥管法不是原位冷凍和解凍，微滴在吸與吐的過程中易丟失精子且液量大精子難找，導(dǎo)致精子回收率低。新型超微量冷凍載體采用超微量冷凍體積，冷凍復(fù)蘇速率快，精子凍融損傷小，其精子存活率優(yōu)于超微量冷凍麥管法。本研究新型超微量冷凍載體復(fù)蘇后活動精子率與超微量冷凍麥管法未見差異，可能原因是薄片載體在冷凍操作時吸附有礦物油，對精子凍融產(chǎn)生損傷，且解凍后30min計數(shù)活動精子，存在部分精子活力尚未恢復(fù)的可能。基于精子回收率、存活率等直觀精子復(fù)蘇指標(biāo)的優(yōu)越性，新型超微量冷凍載體是稀少精子凍融載體的良好選擇。

冷凍液體積大小與冷凍精子的回收率和存活率密切相關(guān)。Endo等[2]發(fā)現(xiàn)3.5μl冷凍量似乎能獲得較高的精子存活率，而0.5μl冷凍量的精子存活率最低。馬超等[11]發(fā)現(xiàn)3.5μl微滴量與0.5μl微滴量的精子回收率、活動率和存活率沒有差異。本文發(fā)現(xiàn)新型組0.5μl、1μl、2μl微滴量的精子回收率、活動率和存活率沒有差異，但2μl冷凍體積相對較大，尋找精子時間長，操作性相對差；而0.5μl微滴量在配皿過程中滲透壓容易改變，操作性差。1μl相對合理，操作性較強(qiáng)。

精子受精及受精卵分裂是評估精子冷凍效果的臨床指標(biāo)。文獻(xiàn)報道常規(guī)微量冷凍的精子解凍后行ICSI能取得與新鮮精子相似的受精率及臨床妊娠率[12]。本文對新型超微量冷凍載體法冷凍的精子解凍后挑選存活精子進(jìn)行ICSI授精，其受精率和卵裂率在冷凍精子組與新鮮精子組間未見差異，與國內(nèi)外報道基本一致[12-13]。

綜上所述，用新型超微量冷凍載體凍融稀少精子能獲得較高的精子回收率、活動率和存活率，載體黑色冷凍標(biāo)識圈易識別，縮短找精子時間，薄片可在ICSI操作皿中直接使用，簡單方便，有較好的臨床應(yīng)用價值。本文觀察的精子更接近非梗阻性無精子癥或隱匿性精子癥患者的精子狀態(tài)，為該類患者稀少精子凍融的臨床應(yīng)用提供參考。但需注意：新型超微量冷凍載體的薄片厚，在ICSI操作時需升高注射針，否則易斷針或?qū)е卤∑莆?，影響操作連慣性；此外，新型薄片載體在冷凍操作中吸附有礦物油，對精子凍融質(zhì)量有負(fù)面影響，需在今后工作中加以改進(jìn)。