孫明明 劉婷婷 樊倩倩 祝立權(quán) 梁 敏 張博男 刁 天 暴 國(guó) 陳西華 徐祥波 賀 斌*

1.國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所(北京 ,100081)；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院

一次成功的妊娠需要足夠的胎盤(pán)血管化以保證在整個(gè)妊娠期維持胎盤(pán)血管的數(shù)量，良好的胎盤(pán)血管網(wǎng)和血流灌注可滿(mǎn)足胎兒發(fā)育生長(zhǎng)的需要[1]。胎盤(pán)血管網(wǎng)發(fā)育異常直接影響胎盤(pán)血液循環(huán)，導(dǎo)致子宮胎盤(pán)血流量不足，可引起流產(chǎn)、先兆子癇、胎兒宮內(nèi)發(fā)育受限等許多妊娠疾病[2]。妊娠時(shí)血清雌激素水平隨孕周升高，雌激素在妊娠早期由卵巢黃體產(chǎn)生，妊娠9周后主要由胎兒-胎盤(pán)單位合成，至妊娠末期，正常妊娠處于高雌激素狀態(tài)，雌三醇值為非孕期的1000倍，雌二醇(E2)及雌酮為非孕期的100倍[3]。另一方面，有研究顯示孕早期絨毛或胎盤(pán)組織中的E2濃度明顯高于外周血清，至足月分娩時(shí)則相反[4]。雌激素是維持妊娠的重要甾體激素，目前普遍認(rèn)為雌激素具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用，特別是血管的形成[5]。但雌激素是否在妊娠期胎盤(pán)血管生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)中起重要作用尚未得到充分研究，且妊娠期間E2水平的大幅變化對(duì)胎盤(pán)血管化的影響也需要更加深入細(xì)致的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和主要試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC,北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)；17β-雌二醇(E2)、CCK-8試劑盒(美國(guó)Sigma公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)；ECM培養(yǎng)基(美國(guó)Sciencell公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；Transweel小室(美國(guó)Corning公司)；培養(yǎng)箱(Memmert，德國(guó))，酶標(biāo)儀(K3 plus，上海寶玉德)，顯微鏡(LDM6000，德國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于ECM完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，待生長(zhǎng)到80%～90%細(xì)胞發(fā)生融合時(shí)，0.25% 胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞分組將HUVECs隨機(jī)分為空白對(duì)照組和不同E2濃度(1×10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)干預(yù)組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。其中10-9～10-8mol/L濃度接近孕期外周血清雌激素生理濃度[6-7]。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化液消化細(xì)胞，制得細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，每組5個(gè)復(fù)孔。每孔接種100 μl細(xì)胞懸液于96孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；棄掉培養(yǎng)液，每孔加入100 μl含有雌激素的完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0,1,2 ,3 d；然后將培養(yǎng)液棄去，在每孔內(nèi)加入含有10 μl CCK-8試劑的培養(yǎng)基100 μl，根據(jù)細(xì)胞增殖情況在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1～4 h；用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml，接種于6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。第2天用槍頭在培養(yǎng)皿底部劃出水平劃痕，用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基；放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在0,12,24,48 h拍照記錄；結(jié)果數(shù)據(jù)采用Image-J軟件進(jìn)行分析。

1.2.5細(xì)胞侵襲試驗(yàn)將ECM培養(yǎng)基用Matrigel膠按5:1的比例稀釋?zhuān)?0 μl/孔均勻鋪于Transwell小室放室內(nèi)37℃靜置2 h，使Matrigel膠凝固。取含有不同濃度E2的細(xì)胞懸液(1×105個(gè)/ml)，取100 μl細(xì)胞懸液加入到小室中，在24孔板中加入600 μl的完全培養(yǎng)基，將小室置于24孔板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12,24,48 h后取出小室；加入4%多聚甲醛室溫下固定15 min，5%結(jié)晶紫染色15 min，擦去小室中的Matrigel膠及細(xì)胞，用倒置顯微鏡對(duì)進(jìn)行觀察，拍照計(jì)數(shù)。

1.2.6成管試驗(yàn)將預(yù)冷的Matrriel基質(zhì)膠鋪于96孔板中，每孔50 μl，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，靜置60 min，使其凝固；加入含有不同濃度E2的細(xì)胞懸液(2×104個(gè)/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，觀察各組細(xì)胞成管數(shù)量，并隨機(jī)選擇6個(gè)視野拍照，并用Image J軟件進(jìn)行分析處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 E2對(duì)HUVECs增殖的影響

與空白對(duì)照組相比，10-8mol/L組細(xì)胞活力明顯提高(P<0.05)，而10-6mol/L組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 E2對(duì)HUVECs遷移的影響

與空白對(duì)照組相比，10-10mol/L組細(xì)胞遷移率升高(P<0.05)，隨著E2濃度升高，10-9、10-8mol/L組細(xì)胞遷移率明顯升高(P<0.01)，而10-6mol/L組細(xì)胞遷移率明顯受到抑制(P<0.01)，見(jiàn)表1，圖1(見(jiàn)插頁(yè))。

2.3 E2對(duì)HUVECs侵襲的影響

與空白對(duì)照組相比，10-10mol/L組細(xì)胞侵襲能力升高(P<0.05)，隨著E2濃度升高，10-9、10-8mol/L組細(xì)胞侵襲能力明顯升高(P<0.01)，而10-6mol/L組細(xì)胞侵襲能力明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表1，圖2(見(jiàn)插頁(yè))。

2.4 E2對(duì)HUVECs成管能力的影響

不同濃度的E2對(duì)HUVECs管腔形成能力顯示出不同的作用，當(dāng)E2濃度為10-9、10-8mol/L時(shí)，具有明顯促進(jìn)作用；E2達(dá)到10-6mol/L時(shí)，表現(xiàn)出明顯抑制作用(P<0.01)。見(jiàn)表1，圖3(見(jiàn)插頁(yè))。

表1 不同濃度E2對(duì)HUVEC影響

3 討論

胎盤(pán)位于母胎界面，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)環(huán)境以促進(jìn)最佳胎兒發(fā)育。胎盤(pán)血竇密集的血管網(wǎng)絡(luò)保障了整個(gè)孕期母嬰之間交換呼吸氣體、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，這對(duì)胎兒的正常成長(zhǎng)至關(guān)重要[8]。胎盤(pán)血管網(wǎng)系統(tǒng)的異常發(fā)育導(dǎo)致胎盤(pán)功能不全，這可能導(dǎo)致母體和胎兒循環(huán)之間的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和廢物交換減少。這種變化可能在不利的子宮環(huán)境中表現(xiàn)出來(lái)，導(dǎo)致母親和胎兒的各種妊娠并發(fā)癥，包括妊娠期高血壓、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、先兆子癇、死產(chǎn)、早產(chǎn)或流產(chǎn)等[9]。因此，胎盤(pán)內(nèi)血管網(wǎng)的正確建立對(duì)于胎兒的生長(zhǎng)和存活至關(guān)重要，并可作為緩解與胎盤(pán)血管系統(tǒng)改變有關(guān)的臨床狀況的治療目標(biāo)。

胎盤(pán)血管網(wǎng)絡(luò)形成主要包括血管發(fā)生和血管生成兩個(gè)過(guò)程，在多種促血管生成因子、抑血管生成因子、缺氧等刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞開(kāi)始增殖、遷移，同時(shí)分泌多種酶水解重構(gòu)基質(zhì)，最終形成豐富的管腔結(jié)構(gòu)[9]，從而促進(jìn)胎盤(pán)的快速生長(zhǎng)，并確保胎兒有效的營(yíng)養(yǎng)供給。大量研究提示雌激素和血管生成因子之間交互作用，并且主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)血管生成過(guò)程[10]。

女性的非妊娠期外周血E2濃度約在0.1～2.2 nmol/L范圍內(nèi)[11]，妊娠時(shí)血清E2水平隨孕周增大逐漸升高，E2平均濃度約從孕早期10-9mol/L增加到孕晚期的10-8mol/L[7，12]。本研究選擇了1×10-10～1×10-6濃度梯度的E2，研究結(jié)果顯示，隨著E2濃度的升高，E2對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及成管能力的促進(jìn)作用也隨之加強(qiáng)，并在1×10-8濃度時(shí)達(dá)到高峰，特別是對(duì)HUVECs的遷移和侵襲能力可以增加2倍左右，隨著E2濃度的繼續(xù)提高，高濃度的E2則出現(xiàn)相應(yīng)的抑制作用。結(jié)果提示E2對(duì)HUVECs的增殖、遷移、侵襲以及成管能力的影響具有劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著E2濃度增加可以促進(jìn)HUVECs的增殖、遷移、侵襲和成管，但是過(guò)高的濃度可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和成管。研究顯示，先兆子癇患者孕早期雌激素明顯降低[13-14]，并提出先兆子癇的雌激素缺乏假說(shuō)[11]，但E2參與血管發(fā)生在先兆子癇發(fā)病機(jī)制中的具體作用仍有待于進(jìn)一步深入研究。胎盤(pán)中異常的血管生成可以導(dǎo)致母體螺旋動(dòng)脈的重塑受損和胎盤(pán)灌注不足，已成為胎盤(pán)功能不全及其臨床后果的主要病理生理特征之一，例如胎兒生長(zhǎng)受限和母體先兆子癇等，認(rèn)為與妊娠期低水平雌激素有關(guān)[15]，并開(kāi)始探索E2水平作為早孕流產(chǎn)[16]、先兆子癇[10]等妊娠疾病發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志物的可行性。

值得注意的是，妊娠時(shí)胎盤(pán)也合成雌激素，并且大約在妊娠9周時(shí)成為雌激素的主要來(lái)源，有研究顯示孕早期胎盤(pán)局部微環(huán)境具有更高的雌激素濃度[4]，而且，E2代謝物2-甲氧雌二醇(2-ME2)是一種有效的抗血管生成因子，無(wú)增殖活性[17]；2-ME2抑制VEGF合成和血管小管形成，并誘導(dǎo)微管蛋白聚合破壞[18]。這也反應(yīng)了在胎盤(pán)發(fā)育的特殊微環(huán)境中，E2對(duì)胎盤(pán)血管網(wǎng)形成的復(fù)雜精細(xì)調(diào)控，相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。