楊 楠 丁 錨 黃語(yǔ)悠 房亞蘭 師文娟 趙詠梅

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053)

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族成員。NGF是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的生物活性分子之一，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)起重要作用。BDNF是一種廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[4]，與神經(jīng)元損傷后再生修復(fù)有關(guān)。研究[5]顯示，永久性腦缺血后，NGF和BDNF表達(dá)上調(diào)，但再灌注后NGF和BDNF如何變化卻鮮有報(bào)道。缺血半暗帶區(qū)是指存在于腦梗死中心部位周?chē)娜毖珱](méi)有壞死的、處于可逆狀態(tài)的腦組織區(qū)域，由于血管再通和挽救更多的缺血半暗帶是腦保護(hù)藥物研發(fā)的一個(gè)重要靶點(diǎn)，所以探究再灌注后缺血半暗帶區(qū)NGF和BDNF的表達(dá)變化十分重要。研究[6-7]顯示，NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)突起的生長(zhǎng)需要NO的存在，NO可通過(guò)cGMP通路誘導(dǎo)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生NGF。內(nèi)源性NO能調(diào)控BDNF的產(chǎn)生，同時(shí)BDNF也能誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元中NO的產(chǎn)生[8]，說(shuō)明NO和BDNF可以相互調(diào)節(jié)。研究[6-8]顯示，NO參與NGF和BDNF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族成員的調(diào)控。本研究采用大鼠大腦中動(dòng)脈梗死(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型即短暫性局灶性腦缺血模型，觀(guān)察腦缺血再灌注大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)NGF和BDNF表達(dá)的變化，以及應(yīng)用NO合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)，對(duì)腦缺血大鼠再灌注后NGF、BDNF表達(dá)的影響，從而研究在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中NGF和BDNF表達(dá)隨再灌注時(shí)間變化的趨勢(shì)以及NO對(duì)其表達(dá)的調(diào)控，探討腦缺血損傷的深層機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～320 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。42只SD大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為7組：假手術(shù)(Sham)組；MCAO再灌注0 h(MCAO 0 h)組；MCAO再灌注6 h(MCAO 6 h)組；MCAO再灌注12 h(MCAO 12 h)組；MCAO再灌注24 h(MCAO 24 h)組；MCAO再灌注72 h(MCAO 72 h)組；以及MCAO 24 h+L-NAME組。每組6只大鼠。MCAO術(shù)前30 min腹腔注射L-NAME[溶于0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，1 mg/kg]，Sham組和MCAO組大鼠腹腔注射同等體積0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液。

1.2 儀器及試劑

小動(dòng)物呼吸機(jī)和麻醉機(jī)(美國(guó)Harvard Apparatus公司)、手術(shù)顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss公司)、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(CMA 150,瑞典Carnegie Medicin公司)、雙極電凝器(DEVEL，ACC100)、冰凍切片機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)、熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。恩氟烷和水合氯醛購(gòu)自河北一品制藥公司，L-NAME購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，3-NT、NGF、BDNF抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 動(dòng)物模型制作

MCAO大鼠模型的制備依照改良Zea Longa法。先在70%(體積分?jǐn)?shù))N2O和30%(體積分?jǐn)?shù))O2中混合5%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷誘導(dǎo)麻醉，后改用2%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷維持麻醉。沿大鼠經(jīng)頸部作正中切口，切開(kāi)皮膚和皮下組織，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈并夾閉，頸外動(dòng)脈凝斷后，將尼龍線(xiàn)栓自頸外動(dòng)脈殘端插進(jìn)頸內(nèi)動(dòng)脈，至線(xiàn)栓頂端到達(dá)距頸總動(dòng)脈分叉約1.8～2.0 cm 有阻力感處停止。缺血90 min后，拔出線(xiàn)栓進(jìn)行再灌注。逐層縫合肌肉、皮膚，再次消毒。術(shù)中監(jiān)測(cè)大鼠各項(xiàng)生理參數(shù)在正常范圍[9]。

1.4 免疫熒光染色

MCAO組大鼠于再灌注0、6、12、24及72 h，用水合氯醛麻醉，處死取腦，用OCT包埋后，行厚度為20 μm 的連續(xù)冰凍切片。用預(yù)冷的4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定10 min后，用0.2%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100進(jìn)行破膜10 min，滴加5%(體積分?jǐn)?shù))正常山羊血清室溫封閉30 min，棄血清，滴加一抗(NGF抗體做1∶200稀釋?zhuān)珺DNF抗體做1∶200稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。陰性對(duì)照不加一抗，用PBS替代。次日將切片用PBS洗后，滴加熒光二抗(1∶300稀釋)，室溫避光孵育1 h。PBS漂洗后，用含DAPI的封片劑封片。

1.5 免疫熒光雙標(biāo)染色

取Sham組、MCAO 24 h組以及MCAO 24 h+L-NAME組大鼠腦組織冰凍切片，于預(yù)冷的4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛中固定10 min后，用0.2%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100破膜10 min，之后滴加5%(體積分?jǐn)?shù))山羊血清室溫封閉30 min，棄血清，滴加3-NT與NGF抗體(3-NT抗體做1∶300稀釋?zhuān)琋GF抗體做1∶200稀釋)，或3-NT與BDNF抗體(3-NT抗體做1∶300稀釋?zhuān)珺DNF抗體做1∶200稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。陰性對(duì)照不加一抗，用PBS替代。次日將切片用PBS洗后，滴加熒光二抗(1∶300稀釋)，室溫避光孵育1 h。PBS漂洗后，用含DAPI的封片劑封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腦缺血大鼠再灌注后各時(shí)間點(diǎn)缺血半暗帶區(qū)NGF和BDNF表達(dá)的變化

腦缺血大鼠再灌注后各時(shí)間點(diǎn)缺血半暗帶區(qū)NGF和BDNF表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(2，12)=1119.93，P<0.05)。MCAO再灌注0、6 h組大鼠腦組織幾乎見(jiàn)不到NGF和BDNF陽(yáng)性細(xì)胞。MCAO再灌注12 h組大鼠，腦缺血半暗帶區(qū)域可見(jiàn)NGF和BDNF陽(yáng)性細(xì)胞，數(shù)量與0、6 h組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。再灌注24 h時(shí)，MCAO組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)NGF和BDNF陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量較再灌注12 h組進(jìn)一步增加(P<0.05)；至再灌注72 h，半暗帶區(qū)NGF和BDNF陽(yáng)性染細(xì)胞數(shù)較再灌注24 h組減少(P<0.05)。腦缺血再灌注可引起NGF和BDNF表達(dá)水平上調(diào)，再灌注72 h內(nèi)呈現(xiàn)先升高，再降低的趨勢(shì)(圖1A～C)。

圖1 免疫熒光染色法檢測(cè)再灌注后各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦缺血半暗帶區(qū)NGF和BDNF的表達(dá)Fig.1 Dynamic changes of NGF and BDNF during reperfusion time in cerebral ischemia penumbra of MCAO rats by immunofluorescence stainingA：representative images of NGF-fluorescence staining (red) in MCAO group rats at 0,6,12,24 and 72 h after reperfusion;B:representative images of BDNF-fluorescence staining (green) in MCAO group rats at 0,6,12,24 and 72 h after reperfusion.Bars=20 μm;C：comparison of NGF and BDNF positive cell numbers in MCAO group rats.n=5.*P<0.05 vs 0 h and 6 h group,#P<0.05 vs 12 h group，△P<0.05 vs 24 h group；NGF:nerve growth factor;BDNF:brain derived neurotrophic factor;MCAO:middle cerebral artery occlusion;DAPI:4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.2 腦缺血大鼠半暗帶區(qū)NGF和BDNF分別與3-NT共定位

MCAO再灌注24 h組大鼠缺血側(cè)半暗帶區(qū)內(nèi)，NGF和BDNF陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色，3-NT陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色，胞核呈藍(lán)色。合并圖像發(fā)現(xiàn)，綠色熒光與紅色熒光重合，表明NGF和BDNF分別與3-NT共定位，提示在缺血再灌注后，NGF和BDNF表達(dá)量的上調(diào)與NO的過(guò)量產(chǎn)生相關(guān)(圖2A,B)。

圖2 免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)Sham、MCAO 24 h與MCAO 24 h+L-NAME組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)3-NT與NGF、3-NT與BDNF的表達(dá)Fig.2 Expression of 3-NT (red) and NGF (green),3-NT (red) and BDNF (green) in cerebral ischemia penumbra of rats of Sham,MCAO 24 h and MCAO 24 h+L-NAME groups by immunofluorescence double stainingA:representative double immunofluorescence staining showing the colocalization of 3-NT (red) and NGF (green) in the ischemic penumbra of MCAO rats.B:representative double immunofluorescence staining showing the colocalization of 3-NT (red) and BDNF (green) in the ischemic penumbra of MCAO rats.Bars=20 μm;C:quantification of 3-NT and NGF double staining positive cell.n=5.D:quantification of 3-NT and BDNF double staining positive cell.n=5.*P<0.05 vs Sham group,#P<0.05 vs MCAO group;MCAO:middle cerebral artery occlusion;DAPI:4′,6-diamidino-2-phenylindole;L-NAME:Nω-nitro-L-argininic methyl ester;3-NT:3-nitrotyrosine;NGF:nerve growth factor;BDNF:brain derived neurotrophic factor.

2.3 L-NAME抑制腦缺血大鼠半暗帶區(qū)NGF的表達(dá)

Sham組因沒(méi)有缺血半暗帶區(qū)，其對(duì)應(yīng)腦區(qū)內(nèi)未見(jiàn)3-NT和NGF雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞，MCAO 24 h組大鼠缺血半暗帶區(qū)可見(jiàn)大量的3-NT和NGF雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞；MCAO 24 h+L-NAME組大鼠該區(qū)域3-NT和NGF雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比MCAO 24 h組明顯減少(圖2)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(2，12)=339.644，P<0.05)。

2.4 L-NAME抑制腦缺血大鼠半暗帶區(qū)BDNF的表達(dá)

Sham組大鼠未見(jiàn)3-NT和BDNF雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞，MCAO 24 h組大鼠缺血半暗帶區(qū)可見(jiàn)大量的3-NT和BDNF雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞；而MCAO 24 h+L-NAME組大鼠該區(qū)域3-NT和BDNF雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比MCAO 24 h組明顯減少(圖2)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(2，12)= 442.905，P<0.05)。

3 討論

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、成熟和維持神經(jīng)功能的蛋白質(zhì)。研究[10]顯示，生理狀態(tài)下NGF在腦內(nèi)含量極低。劉鵬等[5]發(fā)現(xiàn)，永久性腦缺血模型48 h，大鼠腦內(nèi)NGF和BDNF 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比假手術(shù)組大鼠增加，表明腦缺血本身就能上調(diào)NGF和BDNF的表達(dá)，但腦缺血再灌注后NGF和BDNF表達(dá)如何變化，特別是兩者隨再灌注時(shí)程的變化趨勢(shì)卻鮮有報(bào)道。再灌注引起的血流再通既可使半暗帶腦組織逐漸恢復(fù)正常，亦可使腦損傷繼續(xù)加劇，造成再灌注損傷，因此，研究具有腦保護(hù)作用的NGF和BDNF在再灌注后的表達(dá)變化很有意義。本研究中，腦缺血再灌注可引起大鼠腦組織NGF和BDNF表達(dá)上升，且在24 h內(nèi)隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，NGF和BDNF的表達(dá)水平遞增，至24 h達(dá)到頂峰。由于NGF和BDNF可保護(hù)損傷神經(jīng)元，增強(qiáng)抗凋亡因子表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞存活。因此，大鼠再灌注后24 h內(nèi)NGF和BDNF表達(dá)逐步升高很可能是缺血性腦損傷的一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，缺血大鼠可能通過(guò)NGF和BDNF的代償性增高，來(lái)保護(hù)大鼠腦缺血半暗帶區(qū)內(nèi)處于休眠狀態(tài)或半休眠狀態(tài)的神經(jīng)細(xì)胞，使其向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化并恢復(fù)神經(jīng)功能。本研究中，與再灌注24 h組大鼠相比，再灌注72 h組大鼠腦組織NGF和BDNF的表達(dá)水平有所下降。研究[11]顯示，神經(jīng)元是腦缺血損傷后產(chǎn)生BDNF的唯一來(lái)源，因此，很可能是由于再灌注72 h時(shí)腦組織損傷比再灌注24 h進(jìn)一步加重，神經(jīng)元死亡數(shù)量也進(jìn)一步增多，從而導(dǎo)致此時(shí)NGF和BDNF的表達(dá)水平比再灌注24 h下降。

腦缺血后的神經(jīng)損傷機(jī)制十分復(fù)雜，氧化應(yīng)激是引起腦缺血再灌注損傷的主要因素之一[12]，其中NO在氧化應(yīng)激損傷中的作用尤為重要。腦缺血再灌注后，NOS表達(dá)上調(diào)，NO大量產(chǎn)生[13]。本課題組[9]前期研究結(jié)果表明，NO的含量在再灌注時(shí)升高，至再灌注24 h達(dá)到頂峰。抑制NOS活性可以減少腦組織中NO的產(chǎn)生，對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[14]。本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注24 h大鼠腦內(nèi)NGF和BDNF表達(dá)上調(diào)且均與3-NT共定位，提示腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)NO的過(guò)量產(chǎn)生與NGF和BDNF的上調(diào)存在關(guān)聯(lián)。研究[15]顯示，軸突受到損傷后，神經(jīng)節(jié)中NO活性增加，激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞使其合成NGF增多，而且內(nèi)源性NO能調(diào)控BDNF的產(chǎn)生[8]。因此，可以推測(cè)，在缺血再灌注24 h，過(guò)量產(chǎn)生的NO促進(jìn)了腦缺血再灌注損傷，導(dǎo)致NGF和BDNF的表達(dá)上調(diào)。此時(shí)NGF和BDNF表達(dá)上調(diào)是一種應(yīng)激性上調(diào)，是腦內(nèi)應(yīng)對(duì)損傷的一種內(nèi)源性保護(hù)。

本研究結(jié)果還顯示，MCAO 24 h+L-NAME組大鼠腦內(nèi)的3-NT和NGF雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞、以及3-NT和BDNF雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均比MCAO 24 h組降低，這很可能是由于L-NAME抑制大鼠腦缺血再灌注后NO的產(chǎn)生，降低了腦缺血大鼠的腦損傷程度，從而使得NGF和BDNF的應(yīng)激性上調(diào)有所恢復(fù)。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，過(guò)量的NO引起的腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致了NGF和BDNF表達(dá)的應(yīng)激性上調(diào)。

總之，本研究通過(guò)研究腦缺血大鼠再灌注72 h內(nèi)NGF和BDNF表達(dá)水平的時(shí)程變化，證明在腦缺血再灌注后24 h內(nèi)NGF和BDNF表達(dá)水平持續(xù)增加，與腦缺血損傷的內(nèi)源性保護(hù)有關(guān)。而再灌注72 h，由于神經(jīng)元的大量死亡，腦損傷進(jìn)一步加重，NGF和BDNF表達(dá)水平比再灌注24 h下降。本研究還探究了在再灌注損傷過(guò)程中，NO與NGF和BDNF之間的關(guān)系，證明在腦缺血再灌注24 h內(nèi)，大量產(chǎn)生的NO引起NGF和BDNF的應(yīng)激性上調(diào)，參與腦缺血損傷的內(nèi)源性保護(hù)。使用NOS抑制劑L-NAME清除NO產(chǎn)生了腦保護(hù)作用，NGF和BDNF應(yīng)激性上調(diào)恢復(fù)。本研究為進(jìn)一步探討氧化應(yīng)激和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在腦缺血再灌注損傷中的相互作用提供了科學(xué)依據(jù)。