李 響 蒲連美 阮 楊 李 紅 金澤寧*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院急診危重癥中心，北京 100029；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100070)

脂聯(lián)素(adiponectin，APN)是一種主要由脂肪細(xì)胞分泌的脂肪因子，具有抗感染、胰島素增敏、抗動(dòng)脈粥樣硬化及抗凋亡等特性，在調(diào)節(jié)能量代謝方面發(fā)揮重要作用[1]。脂聯(lián)素受體1(adiponectin receptor 1,ADIPOR1)是介導(dǎo)APN 生物學(xué)效應(yīng)的主要受體之一[2]。ADIPOR1基因過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)APN的生物學(xué)效應(yīng)[3]，而敲除ADIPOR1基因或下調(diào)其表達(dá)活性，可增加胰島素抵抗和糖異生[4]、增加泡沫細(xì)胞的形成，進(jìn)而加速心血管疾病的進(jìn)展[5]。基于共同土壤假說(shuō)[6]，既往研究[7-8]顯示ADIPOR1基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary artery disease，CAD)和2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)等代謝性疾病的易感性相關(guān)。然而，具有如此多效性關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點(diǎn)均位于ADIPOR1基因的內(nèi)含子區(qū)，目前鮮有陽(yáng)性SNPs在ADIPOR1基因非內(nèi)含子區(qū)的報(bào)道。因此，本研究旨在測(cè)序ADIPOR1基因外顯子、5′和3′非翻譯區(qū)(untranslated regions,UTR)區(qū)域，分析ADIPOR1基因非內(nèi)含子區(qū)的SNPs是否與CAD和/或T2D的易感性相關(guān)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2015年1月至2017年11月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心血管相關(guān)內(nèi)科病房住院并行冠狀動(dòng)脈造影檢查的患者1 000例。所有研究對(duì)象均為無(wú)血緣關(guān)系的北方地區(qū)的漢族常住居民,簽署知情同意書并同意提供外周血用于檢測(cè)。此項(xiàng)研究得到首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院倫理審核委員會(huì)的認(rèn)可。符合世界醫(yī)學(xué)會(huì)赫爾辛基宣言：人體醫(yī)學(xué)研究的理論原則。

CAD入選標(biāo)準(zhǔn)(CAD組)：有較為典型的心絞痛癥狀且經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)3支主要血管(前降支、回旋支、右冠狀動(dòng)脈)至少有1支管腔狹窄≥75%。T2D入選標(biāo)準(zhǔn)(T2D組)：≥35歲之后臨床診斷患T2D，需藥物控制血糖(口服降糖藥和/或皮下注射胰島素)>1年且目前仍需使用降糖藥。CAD合并T2D入選標(biāo)準(zhǔn)(CAD+T2D組)：同時(shí)符合CAD和T2D的入選標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn)參照既往研究[9]：冠狀動(dòng)脈造影提示任意血管管腔狹窄<40%，無(wú)CAD和/或T2D的病史和客觀證據(jù)，無(wú)CAD和/或T2D的一級(jí)直系親屬，無(wú)血糖、糖化血紅蛋白、心肌壞死標(biāo)志物、心電圖及超聲心動(dòng)圖異常。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<35歲；②1型糖尿病，糖尿病酮癥酸中毒，高滲性非酮癥糖尿病昏迷，相關(guān)的自體抗體陽(yáng)性；③冠狀動(dòng)脈造影提示存在心肌橋、冠狀動(dòng)脈痙攣或擴(kuò)張，嚴(yán)重心力衰竭(心功能Ⅲ～Ⅳ級(jí))、心肌病或先天性心臟病；④繼發(fā)性高血壓、原發(fā)性腎臟疾病；⑤自身免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡)、癌癥、感染性疾病、嚴(yán)重的心臟瓣膜病，嚴(yán)重的肝和/或腎功能異常、懷孕或圍產(chǎn)期、目前使用特殊藥物(如糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑)。

1.2 研究方法

臨床數(shù)據(jù)的收集：所有的研究對(duì)象在22時(shí)禁食后，于次日早晨進(jìn)行人體測(cè)量，并采集血液樣本進(jìn)行相關(guān)臨床檢測(cè)和DNA提取。對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查，獲得高血壓、高脂血癥和腦梗死病史、用藥史、吸煙或飲酒習(xí)慣(回答“完全沒(méi)有”的被分為從不吸煙或飲酒)及家族史等。根據(jù)歐洲心臟病學(xué)會(huì)和歐洲高血壓學(xué)會(huì)高血壓指南[10]，由訓(xùn)練有素的觀察員測(cè)量血壓。體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)是根據(jù)個(gè)人的身高和體質(zhì)量(kg/m2)計(jì)算出來(lái)的。采用超聲心動(dòng)圖和腹部超聲對(duì)相關(guān)臟器的功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估。

SNPs的選擇及其分型：取EDTA抗凝的外周血0.5 mL，采用全血DNA試劑盒(北京天一輝遠(yuǎn)生命科技有限公司)提取基因組DNA。采用260 nm/280 nm吸光度法測(cè)定提取的DNA質(zhì)量。采用Sanger測(cè)序法3730-XL基因分析儀(美國(guó)Applied Biosystems)測(cè)定SNPs的基因型。

首先對(duì)100例CAD合并T2D的DNA樣本進(jìn)行測(cè)序。所選擇的測(cè)序區(qū)域包括ADIPOR1基因所有外顯子、5′和3′側(cè)翼區(qū)域上下各1 000 bp。然后，篩選次要等位基因頻率>0.05同時(shí)P值<0.3的SNPs(與國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃提供的北京漢族人群相關(guān)SNPs的等位基因進(jìn)行比較，http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)。最終入選以下3個(gè)SNPs進(jìn)行基因分型：rs10581 C>T(位于3′UTR)，rs7539542 G>C(位于3′UTR)及rs7517286 T>C(位于5′UTR)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基線資料

通過(guò)重新核對(duì)出院時(shí)的臨床資料以及對(duì)各組間的性別、年齡及BMI進(jìn)行匹配，1 000例樣本中共有737個(gè)符合條件并進(jìn)行了基因分型。最終入選對(duì)照組193例，T2D組142例，CAD組203例，CAD+T2D組199例。4組研究對(duì)象的臨床及實(shí)驗(yàn)室資料詳見(jiàn)表1。組間比較的結(jié)果詳見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，CAD組、T2D組及CAD+T2D組有較高比例的高血壓患者(67.1%、67.6%,70.4%vs39.9%,P<0.001)和較低水平的高密度脂蛋白膽固醇(0.96、1.02、0.96 mmol/Lvs1.13 mmol/L,P<0.001)。

表1 4組間臨床基線資料比較Tab.1 Comparison of clinical and demographic characteristics

表2 各組間臨床資料的多重比較Tab.2 Multiple comparison of clinical and demographic characteristics

2.2 SNPs關(guān)聯(lián)分析

對(duì)照組的基因型頻率均符合HWE(PHWE>0.05),詳見(jiàn)表3。測(cè)序圖詳見(jiàn)圖1。rs7539542等位基因和基因型頻率在4組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=9.62×10-6和P=3.94×10-4)，詳見(jiàn)表3。通過(guò)顯性、隱性及加性遺傳模型分析，rs7539542 C與CAD(OR=1.67～2.34,P=2.87×10-4～0.002)和CAD合并T2D(OR=1.52～2.08,P=0.003～0.016)的易感性相關(guān)，與T2D的易感性無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(P>0.05),詳見(jiàn)表4。進(jìn)一步對(duì)疾病狀態(tài)進(jìn)行分層分析(表5)，發(fā)現(xiàn)rs7539542 C增加T2D患者CAD的易感風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.58～2.9,P=0.002～0.038)。rs7517286和rs10581的等位基因間存在連鎖不平衡(圖2)，兩者的等位基因和基因型頻率在4組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。

圖2 ADIPOR1基因3個(gè)SNPs在對(duì)照組中的連鎖不平衡分析圖Fig.2 Linkage disequilibrium plots of 3 SNPs in ADIPOR1 gene in control group SNPs:single nucleotide polymorphisms.

表3 ADIPOR1基因3個(gè)SNPs的等位基因和基因型的分布Tab.3 Allelic and genotypic frequencies of 3 SNPs in ADIPOR1 n(%)

如表1所示,3個(gè)病例組中高血壓的患病率明顯高于對(duì)照組(66.5%vs39.9%,χ2=42.001,P=9.12×10-11)?？紤]到高血壓是心血管疾病的影響因素，于是對(duì)是否患高血壓進(jìn)行分層分析。結(jié)果顯示在非高血壓亞組，rs7539542 C與CAD(OR=2.03～3,P=0.001～0.008)和CAD合并T2D(OR=1.92～3.3,P=0.004～0.025)的易感性相關(guān)，詳見(jiàn)表4,并增加T2D患者CAD的易感風(fēng)險(xiǎn)(隱性模型：P=0.018,OR=4.46；加性模型：P=0.038,OR=1.82)，詳見(jiàn)表5。

表4 ADIPOR1基因rs7539542位點(diǎn)與CAD、T2D及CAD合并T2D的關(guān)聯(lián)分析Tab.4 Association of rs7539542 in ADIPOR1 with T2D,CAD and T2D with CAD

表5 ADIPOR1基因rs7539542位點(diǎn)與疾病狀態(tài)的關(guān)聯(lián)分析Tab.5 Association of rs7539542 in ADIPOR1 with diseases stratified by CAD or T2D status

rs7539542基因型與高血壓交互作用的P值范圍為0.14～0.86(表6)，提示rs7539542基因型與高血壓無(wú)顯著的交互作用。對(duì)照組進(jìn)行高血壓的分層分析，也未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果(P值范圍為 0.157～0.263)。

表6 ADIPOR1基因rs7539542位點(diǎn)基因型和高血壓的交互作用Tab.6 rs7539542 genotype-hypertension interaction

2.3 基因與環(huán)境的交互作用

采用Logistic回歸分析方法對(duì)非高血壓亞組進(jìn)行基因-環(huán)境的交互作用分析。結(jié)果顯示，與rs7539542 CG+GG攜帶者相比，rs7539542 CC攜帶者與三酰甘油(triglycerides，TG)存在交互作用，并增加CAD (P=0.041,OR=5.006,95%CI=1.066～23.51)和CAD合并T2D的易感風(fēng)險(xiǎn)(P=0.04,OR=5.381,95%CI=1.081～26.786)。

3 討論

本研究結(jié)果提示在中國(guó)北方漢族人群中，rs7539542不僅與CAD和CAD合并T2D的易感性有關(guān)，還增加T2D患者的CAD易感風(fēng)險(xiǎn)。這一發(fā)現(xiàn)與本課題組既往研究[9]結(jié)果相一致,rs7539542與中國(guó)北方漢族人群的CAD易感性有關(guān)。Soccio等[11]對(duì)高加索人群的研究提示,rs7539542增加T2D患者的CAD易感風(fēng)險(xiǎn)。然而，本研究不能復(fù)制rs7539542與T2D的易感關(guān)聯(lián)。Qi等[12]的研究顯示,rs7539542(也稱為rs1139646)與女性白種人的T2D易感性有關(guān)。但本研究對(duì)樣本進(jìn)行性別分層分析后并未發(fā)現(xiàn)上述關(guān)聯(lián)(結(jié)果未列出)。這一陰性關(guān)聯(lián)與既往在高加索人[13-15]、東亞人(如日本[16]和韓國(guó)[17])和非洲[13]人群中的研究結(jié)果一致。目前無(wú)明確證據(jù)提示rs7539542和T2D的易感風(fēng)險(xiǎn)間存在關(guān)聯(lián)性。也就是說(shuō)，rs7539542與CAD的易感性關(guān)聯(lián)可能獨(dú)立于T2D。

考慮到3個(gè)病例組樣本中高血壓的患病率較高，故對(duì)血壓進(jìn)行分層分析，結(jié)果表明與總體樣本一致的結(jié)論僅出現(xiàn)在非高血壓亞組。因高血壓被認(rèn)為是CAD主要的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素之一，不除外與rs7539542存在交互作用。故在各病例組間對(duì)rs7539542基因型與血壓的交互作用進(jìn)行檢測(cè)，還在對(duì)照組中對(duì)血壓進(jìn)行分層分析，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)rs7539542與血壓之間有顯著的交互作用。這提示rs7539542與CAD的易感性關(guān)聯(lián)可能獨(dú)立于血壓的影響。

環(huán)境因素在慢性代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，并可能影響基因?qū)膊〉谋硇?。因此，在非高血壓病例組中，進(jìn)一步分析了基因與環(huán)境因素的交互作用。結(jié)果顯示，rs7539542 CC基因型與TG存在交互作用，增加CAD、CAD合并T2D的易感風(fēng)險(xiǎn)(OR分別為5.006和5.381)?？梢钥闯觯crs7539542單獨(dú)分析相比，rs7539542聯(lián)合TG后明顯增加CAD和CAD合并T2D的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)(即OR值)。在高脂血癥中，除低密度脂蛋白膽固醇外，高濃度的TG也被認(rèn)為是CAD的危險(xiǎn)因素[18]。血漿低濃度的脂聯(lián)素[1]和ADIPOR1多態(tài)性[18]與高濃度的TG相關(guān)。因此是否對(duì)rs7539542風(fēng)險(xiǎn)基因攜帶者進(jìn)行早期血脂篩查并強(qiáng)化降脂治療有待進(jìn)一步研究。

本研究存在一些局限性。一方面缺乏功能學(xué)研究，例如檢測(cè)rs7539542 microRNA，進(jìn)一步檢驗(yàn)rs7539542是否是影響CAD遺傳基礎(chǔ)的功能變異位點(diǎn)。尤其是既往研究[11]顯示,rs7539542影響ADIPOR1基因的表達(dá)。另一方面，本研究樣本量不足可能降低了檢驗(yàn)效能，尤其在亞組或分層分析中。但本研究具有嚴(yán)格的入排標(biāo)準(zhǔn)，并通過(guò)入選極端表型來(lái)增強(qiáng)檢測(cè)等位基因差異的能力。如CAD組入選標(biāo)準(zhǔn)為具有較為典型的心絞痛癥狀且冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)為主要血管至少有1支管腔狹窄≥75%，并非傳統(tǒng)意義的以管腔狹窄≥50%為入選標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)除外了心肌橋、冠狀動(dòng)脈痙攣及嚴(yán)重?cái)U(kuò)張等非動(dòng)脈粥樣硬化造成管腔狹窄的情況；再如T2D入選標(biāo)準(zhǔn)為需藥物控制血糖>1年且目前仍需使用降糖藥，除外輕型(如通過(guò)運(yùn)動(dòng)和飲食即可控制血糖)、一過(guò)性、藥物源性或相關(guān)抗體陽(yáng)性的血糖增高患者。此外，本研究在各組間對(duì)一些如性別、年齡及BMI等CAD和T2D的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素進(jìn)行了匹配，盡可能降低了混雜因素對(duì)結(jié)果的影響。考慮到CAD和T2D均為慢性復(fù)雜性疾病，受多基因和環(huán)境因素的相互影響，故ADIPOR1基因單多態(tài)位點(diǎn)在CAD和T2D發(fā)生發(fā)展中的作用及其臨床應(yīng)用價(jià)值尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，通過(guò)多病例-對(duì)照的研究方法，本研究發(fā)現(xiàn)了位于ADIPOR1基因非內(nèi)含子區(qū)域的rs7539542多態(tài)位點(diǎn)不僅與CAD和CAD合并T2D的易感性相關(guān)，還增加T2D患者CAD的易感風(fēng)險(xiǎn)，尤其是在非高血壓患者中。此外，rs7539542與TG存在交互作用，進(jìn)一步提高了CAD和CAD合并T2D的易感風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步研究ADIPOR1基因在CAD發(fā)生發(fā)展中的作用。