王振中 喻 飛 楊 波 馬立峰*

(1.北京積水潭醫(yī)院骨科，北京 100035;2.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院骨科，北京 100050)

骨性關節(jié)炎作為一種退行性關節(jié)疾病，特征為關節(jié)軟骨的磨損、變薄甚至缺損，軟骨下骨的硬化，骨贅形成以及滑膜組織的炎癥性改變等；最終導致疼痛和關節(jié)功能異常[1-2]。然而該疾病的病理過程尚未完全闡明，眾多研究[2-5]表明，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的過度表達，尤其是MMP-13的表達在骨性關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。富血小板血漿(platelet-rich plasm，PRP)，是富含血小板的全血提取物，血小板經(jīng)過脫顆粒作用能夠釋放多種生長因子，包括轉化生長因子β、血小板源生長因子等。實驗[6-10]證明這些因子可抑制炎癥過程，促進軟骨基質的合成而發(fā)揮軟骨保護作用。然而其對MMP-13的作用目前無相關報道，本實驗旨在探討PRP通過抑制MMP-13表達而發(fā)揮軟骨保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只成年純種新西蘭雄性大白兔，體質量1 800～2 000，平均(1 900±200)，由首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院實驗動物中心提供[實驗動物許可證號：SYXK(京)2018-0003]，采用數(shù)字表法隨機分為對照組、關節(jié)炎組、PRP組。其中,關節(jié)炎組和PRP組給予10%(質量分數(shù))水合氯醛3 mL腹腔麻醉，常規(guī)備皮、消毒、鋪無菌單，取左后肢膝關節(jié)內側切口3 cm，切開皮膚皮下關節(jié)囊，切除內側半月板，切斷前后交叉韌帶，保護關節(jié)軟骨，用慶大霉素0.9%(質量分數(shù))氯化鈉注射液沖洗關節(jié)腔，妥善止血后逐層關閉切口，傷口妥善包扎。對照組僅切開關節(jié)囊，用慶大霉素0.9%(質量分數(shù))氯化鈉注射液沖洗傷口后關閉傷口。術后飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境下，并定期給予傷口換藥處理[11]。于術后第一周，將凍存的PRP于恒溫箱中解凍后，給予PRP組關節(jié)腔內注射PRP 0.2 mL，其他兩組給予等量注射0.9%(質量分數(shù))氯化鈉注射液。術后第五周，空氣栓塞法處死各組兔，獲取左膝關節(jié)。

1.2 PRP的制備

術前于兔右耳緣中部暴露耳緣靜脈，以乙醇消毒后抽取5 mL靜脈血，置于枸櫞酸鈉抗凝管中，按照Aghaloo兩步離心沉淀法[8]制備0.2 mL PRP，置于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 軟骨厚度測量

切取各組兔膝關節(jié)內側股骨髁負重區(qū)全層軟骨切片3 mm，經(jīng)過10%(體積分數(shù))甲醛固定，脫水，脫鈣，石蠟固定，HE染色，顯微鏡下測量軟骨厚度，并計算各組平均值。

1.4 免疫組織化學染色

用MMP-13單抗(1∶50，美國圣克魯茲生物技術公司)和生物素標記的山羊抗兔二抗(1∶100，美國圣克魯茲生物技術公司)分別孵育固定后的內側股骨髁負重區(qū)軟骨切片，顯影劑顯影后于鏡下計數(shù)MMP-13陽性細胞數(shù)。

1.5 免疫熒光定量MMP-13

軟骨切去剩余股骨內側髁軟骨層，用膠原酶分解軟骨，離心分解液獲取軟骨細胞，每組等分為兩份。將細胞以1×105個/孔接種于6孔板，經(jīng)包膜穿孔，用MMP-13單抗(1∶50，美國圣克魯茲生物技術公司)孵育，染色劑染色，于熒光顯微鏡下觀察，通過Image-pro Plus 6.0軟件分析熒光強度。

1.6 Western blotting法檢測MMP-13表達量

將獲得的各組軟骨細胞裂解，提取MMP-13蛋白，以β-actin為內參，檢測各組MMP-13 蛋白表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組關節(jié)軟骨形態(tài)和厚度變化

各組兔膝關節(jié)軟骨HE染色顯示對照組關節(jié)軟骨表面平滑，關節(jié)軟骨各層結構完好，厚度基本正常；關節(jié)炎組軟骨表面毛糙，軟骨內結構紊亂，軟骨厚度丟失明顯；PRP干預后，軟骨厚度得以保留，軟骨結構也有明顯改善，詳見圖1。3組間軟骨厚度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，關節(jié)炎組明顯低于對照組和PRP干預組，詳見表1。

圖1 各組兔膝關節(jié)軟骨厚度Fig.1 Cartilage thickness in every groupA:HE staining(100×);B:statistics data;a:control group;b:osteorathritic group;c:platelet-rich plasm group;*P<0.05 vs control group and platelet-rich group.

表1 各組軟骨厚度Tab.1 Cartilage thickness

2.2 軟骨內MMP-13陽性細胞數(shù)

免疫組織化學染色結果詳見圖2。3組間軟骨內MMP-13陽性細胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中關節(jié)炎組關節(jié)軟骨內MMP-13陽性細胞數(shù)量明顯高于對照組,PRP干預后MMP-13陽性細胞數(shù)明顯降低(P<0.05),詳見表2。

表2 軟骨內MMP-13陽性細胞數(shù)Tab.2 Number of MMP-13 positive cells

2.3 MMP-13蛋白免疫熒光定量

免疫熒光顯像結果詳見圖3。3組間軟骨內MMP-13表達量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，關節(jié)炎組MMP-13表達量高于對照組，PRP干預后MMP-13的表達量明顯降低,組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見表3。

表3 各組兔膝關節(jié)軟骨細胞MMP-13蛋白熒光顯像結果Tab.3 Immunohistochemical staining result

圖3 各組兔膝關節(jié)軟骨細胞MMP-13蛋白熒光顯像Fig.3 Immunohistochemical staining resultA:immunohistochemical staining(200×);B:statistics data;a:control group;b:osteorathritic group;c:platelet-rich plasm group;*P<0.05 vs control group and platelet-rich group;MMP-13：matrix metalloproteinase-13;The red color represented MMP-13 protein.

2.4 MMP-13蛋白表達情況

Western blotting結果(圖4)顯示，關節(jié)炎組隨著關節(jié)炎性反應的出現(xiàn)，MMP-13的表達增多；而PRP的干預能夠明顯降低MMP-13的合成表達,組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖4 各組兔膝關節(jié)軟骨細胞MMP-13蛋白表達量Fig.4 Expression of MMP-13 in each groupA:Western blotting;B:statistic data;a:control group;b:osteorathritic group;c:platelet-rich plasm group;*P<0.05 vs control group and platelet-rich group;MMP-13:matrix metalloproteinase-13.

3 討論

骨性關節(jié)炎的特征性病理過程是Ⅱ型膠原的非生理性降解導致關節(jié)軟骨的破壞，由于關節(jié)軟骨自我修復潛能很低，決定了骨性關節(jié)炎病理過程的不可逆性[1,3]。有研究[2,12]顯示，基質金屬蛋白酶的過度表達是骨性關節(jié)炎病理過程的中心環(huán)節(jié)?；|金屬蛋白酶家族中MMP-13被認為是降解膠原最重要的酶之一，它對Ⅱ型膠原的降解作用是其他MMP的5～10倍[2,13-14]。同時有研究[4,15]顯示，MMP-13定位于關節(jié)軟骨的較深層,該觀點與本實驗的結果相符，免疫熒光染色提示MMP-13陽性細胞多定位于關節(jié)軟骨的中層。因此，延緩骨性關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展，可將抑制MMP-13的過度表達做為治療靶點。

目前對于骨性關節(jié)炎的治療，無論是非甾體藥物還是手術都有一定程度的局限性，而理想的治療方法是有效而不良反應小。PRP作為全血提取物，已經(jīng)應用于臨床多種組織修復中，包括促進肌腱愈合，加速骨修復等[16-18]。PRP活化后可釋放一系列生長因子，包括血小板源性生長因子，轉化生長因子β，Ⅰ型胰島素樣生長因子、血管內皮生長因子等，這些因子廣泛參與到各種組織的修復[16,19-22]；同時，PRP釋放的纖維原等可作為支架，支持組織的修復。也有很多臨床研究[7,23]顯示，PRP具有促進軟骨修復，減輕關節(jié)疼痛的作用，但其具體作用機制不詳?；诖斯P者提出假設PRP是否具有抑制MMP-13表達的作用，并通過動物實驗加以證明。

本實驗選取兔膝關節(jié)骨性關節(jié)炎模型，該模型廣泛應用于骨性關節(jié)炎試驗中，建模成功率高[11]。實驗結束時，關節(jié)炎組兔左后肢膝關節(jié)軟骨磨損明顯，并有不同程度的軟骨下骨硬化和滑膜炎表現(xiàn)，大體符合骨性關節(jié)炎的表現(xiàn)。通過動物實驗可以觀察到，PRP關節(jié)腔注射減輕了骨性關節(jié)炎的表現(xiàn)，PRP組兔的關節(jié)軟骨厚度得到了保留，同時表面的磨損也明顯減輕。更重要的是，PRP可減少MMP-13陽性細胞的表達，同時抑制MMP-13蛋白的表達。

本實驗證明，PRP是通過抑制MMP-13的表達，從而發(fā)揮軟骨保護作用的。實際上，本研究尚需要進一步完善，包括：①明確PRP釋放的因子中哪些具有軟骨保護作用；②各種因子軟骨保護作用的具體機制。相信隨著研究的不斷深入，PRP軟骨保護作用機制將被進一步闡明，為更好治療骨性關節(jié)炎提供客觀實驗依據(jù)。