王 真，李小蘭，劉建國

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563099；2.南充市中心醫(yī)院 口腔科，四川 南充 637000；3.遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州省普通高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c實驗室暨遵義市口腔疾病研究重點實驗室，貴州 遵義 563006)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)自2019年12月中下旬爆發(fā)以來，引起了世界范圍的大流行，截至2020年11月，全球范圍內(nèi)確診人數(shù)超過6 000萬。因此，針對新型冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)疫苗的研發(fā)備受關(guān)注，據(jù)WHO統(tǒng)計，現(xiàn)已有156種候選疫苗得到動物試驗和人體試驗的數(shù)據(jù)支持，在臨床中或即將進入臨床開發(fā)階段[1]。傳統(tǒng)疫苗主要由滅活或減毒的病原體組成[2]，通過注射給藥的方式，引發(fā)機體的體液免疫和細胞免疫，已成功地減少了白喉、破傷風(fēng)、乙型肝炎等傳染原相關(guān)的疾病傳播[3]。但在經(jīng)濟條件相對落后的發(fā)展中國家，傳統(tǒng)疫苗在生產(chǎn)、運輸和儲藏上的高成本，醫(yī)務(wù)人員的缺乏嚴重制約了它的推廣使用。轉(zhuǎn)基因植物疫苗可通過口服免疫途徑遞送抗原，在疫苗的開發(fā)和推廣上具有巨大的優(yōu)勢。我們將基于植物的可食用疫苗在口服免疫途徑的最新研究進展和主要優(yōu)勢進行綜述。

1 以M細胞為核心的胃腸道粘膜免疫機制

口服免疫途徑主要促進胃腸道的粘膜免疫，與外周淋巴組織相比，胃腸道粘膜淋巴系統(tǒng)有兩個方面的特點：①解剖特征上具有特征性的抗原攝取機制，如微皺褶細胞(Microfold cell，M細胞)和派伊爾集合淋巴結(jié)(Peyer’s patches，PP)；②擁有大量活化的T細胞和記憶細胞，并大量啟用分泌型IgA(SIgA)為其效應(yīng)機制。因此，構(gòu)建能夠有效激活特異性SIgA和系統(tǒng)IgG的平臺，是提高口服疫苗效力的關(guān)鍵。

在胃腸道免疫系統(tǒng)中，孤立淋巴濾泡(ILF)、PP和腸系膜淋巴結(jié)(MLNs)作為誘導(dǎo)部位，而上皮內(nèi)淋巴細胞(IEL)和粘膜固有層(LP)構(gòu)成效應(yīng)部位[4]。通常認為抗原是通過以下幾種可能的途徑進入腸粘膜誘導(dǎo)免疫發(fā)生：①抗原通過卵泡相關(guān)上皮(FAE)襯里PP中的M細胞進入腸道免疫系統(tǒng)，再將抗原傳遞給FAE下的潛在樹突狀細胞(DCs)[5]；②DC通過樹突樣的結(jié)構(gòu)延伸至腸腔上皮細胞的緊密連接處，直接攝取抗原，但這種攝取途徑，在以小鼠為模型的動物實驗中似乎局限于某些表達趨化因子受體CX3CR1的DC群體[6]；③卵泡相關(guān)上皮的基底表面具有表達MHC Ⅱ的腸細胞，可充當局部抗原提呈細胞(APC)，某些抗原可移位到卵泡相關(guān)上皮的基底層并遞送到底層DC[7]。

PP由含B細胞豐富的濾泡組織和含T細胞的濾泡間區(qū)組成，被認為是GALT中最大的淋巴組織之一。它受到富含M細胞的卵泡相關(guān)上皮的保護，M細胞可以從腸道攝取和運輸抗原片段[8]。M細胞的特殊構(gòu)造是抗原進入腸道粘膜系統(tǒng)的主要入口。目前許多課題組都正在積極探索針對M細胞的主動靶向機制，以便有效地將抗原傳遞到PP，激活胃腸道粘膜免疫應(yīng)答。

1.1 針對M細胞表面受體的研究 微皺褶細胞(Microfold cell，M細胞)是GALT中的特有細胞，并表達獨特的碳水化合物受體，這些受體為粘膜疫苗的運輸提供了選擇性的靶標，在研究靶向抗原遞送中，M細胞頂端表面上的特異性受體成為研究的重點。凝集素由能夠可逆性結(jié)合特定碳水化合物殘基的蛋白質(zhì)和糖蛋白組成。荊豆凝集素1(UEA-1)能靶向結(jié)合在M細胞上頂端表達的α-L-巖藻受體。與普通抗原顆粒相比，口服用UEA-1修飾的抗原顆粒進行的免疫接種可以顯著提高SIgA 的分泌[9]。另外，細胞因子IL-2和IFN-γ的大量增加還表明有凝集素修飾的抗原顆粒顯示出更強的細胞免疫性。這些結(jié)果表明針對凝集素的策略可能會改善粘膜免疫反應(yīng)。但是，某些凝集素是有毒的，可能具有固有的免疫原性。使用凝集素作為粘膜佐劑在刺激免疫方面可能是有利的，但也可能引發(fā)針對凝集素的免疫反應(yīng)，最終可能阻止抗原的攝取[10]。

其他的在M細胞上表達的蛋白質(zhì)受體也被用于靶向遞送的研究。例如，存在于多種細胞外基質(zhì)中的RGD序列，是一種由精氨酸、甘氨酸和天門冬氨酸組成的肽段，可與11種整合素特異性結(jié)合，能有效地促進細胞對生物材料的粘附。在M細胞頂端常過度表達β1整合素，RGD已被用作靶標，向M細胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運，以降低所需抗原劑量增加體液免疫反應(yīng)。密封蛋白4是在M細胞中高度表達的緊密連接的跨膜蛋白，在設(shè)計抗原時也可以與其靶向結(jié)合，以介導(dǎo)增強SIgA的反應(yīng)[11]。此外，如Nochi等所證明，新型單克隆抗體(NKM 16-2-4)可以將M細胞與杯狀細胞區(qū)分開來，從而獲得了一種能夠防御致命攻擊的高效疫苗[12]。

1.2 從腸道病原體的研究中得到的啟示 腸道病原體可以利用自身表達的細菌粘附素或者病毒蛋白毒素，與M細胞表面的受體特異性結(jié)合，利用M細胞獲得進入宿主的能力。I型鞭毛細菌(大腸桿菌，耶爾森氏菌，沙門氏菌等)的細胞外膜成分中所包含的FimH，可以與人和小鼠的M細胞表面的受體糖蛋白2(GP2)結(jié)合，病原體可以通過與M細胞的結(jié)合躲避由M細胞介導(dǎo)的細菌轉(zhuǎn)胞作用以及之后誘導(dǎo)的粘膜免疫反應(yīng)[13]。同時，耶爾森氏菌還可通過M細胞頂端過表達的β1整合素結(jié)合入侵宿主細胞，根據(jù)耶爾森氏菌的特征開發(fā)重組細菌菌株，已被用于疫苗開發(fā)的相關(guān)研究[14]。

霍亂弧菌所含有的霍亂毒素B亞基(CTB)是一種高效的載體分子，具有良好的免疫原性，能與大多數(shù)哺乳動物細胞表面的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1特異性結(jié)合[15]。CTB是由五個相同的多肽單體組成的穩(wěn)定的五聚體，最多可結(jié)合五個GM1。結(jié)合后的CTB融合蛋白可能通過兩種途徑將抗原蛋白轉(zhuǎn)運到腸上皮細胞中：逆行運輸和轉(zhuǎn)胞吞作用。通過逆行運輸，攜帶抗原的CTB融合蛋白被回收入細胞內(nèi)，到達包括高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在內(nèi)的運輸網(wǎng)絡(luò)中，融合蛋白降解，將抗原蛋白釋放到細胞質(zhì)中[16]。部分GM1受體帶有短酰胺或不飽和脂肪酸鏈的神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)域，可以通過轉(zhuǎn)胞吞作用直接穿過極化的上皮細胞。

Limaye等首次證明了植物中產(chǎn)生的CTB融合蛋白能以口服途徑遞送至胃腸道粘膜[17]。在給小鼠飼喂表達霍亂毒素B亞基-綠色熒光蛋白(CTB-GFP)的植物細胞后，熒光顯微鏡檢查顯示GFP被遞送至小鼠的小腸上皮細胞和M細胞，以及腸粘膜和粘膜下層，并且肝細胞和脾細胞中都存在GFP，這表明口服該融合蛋白可成功地通過腸腔。CTB融合蛋白可被弗林蛋白酶分解，可確保CTB會在目標抗原被攝取吸收后依然保留在上皮細胞中。該方案已經(jīng)成功地應(yīng)用于多種抗原或者治療性蛋白質(zhì)的實驗中，實驗結(jié)果顯示，在口服后2～5 h內(nèi)，在某些情況下最快可以在口服后30 min內(nèi)在小鼠血液循環(huán)中檢測到目的蛋白[18]。

盡管已證明靶向針對M細胞的免疫策略在動物模型中有效，但如何將小鼠模型的實驗結(jié)果轉(zhuǎn)化為人類細胞的研究中，以及如何確保免疫結(jié)果為誘導(dǎo)免疫應(yīng)答而非免疫耐受，還需要進一步的研究。將HT29-MTX粘液分泌杯狀細胞作為M細胞的體外培養(yǎng)模型是一個極具潛力的新進展，該模型可以更好地闡明抗原跨M細胞轉(zhuǎn)運的機制，加速對M細胞特異性受體的鑒別[19]。

2 口服疫苗開發(fā)的限制條件

口服給藥代表了目前治療藥物使用的金標準，是最理想和病人最能接受的給藥途徑[20]?？诜庖咄緩绞侵笇⒁呙缫钥诜倪f送方式，通過腸道相關(guān)淋巴組織(GALT)進行抗原提呈，經(jīng)過不同的免疫通路產(chǎn)生與常規(guī)注射類似的免疫反應(yīng)。相較于注射等其他療法，口服給予了患者自行給藥的機會，改善了病人的依從性。不過，由于胃腸道系統(tǒng)存在的多種理化障礙和生物學(xué)障礙，目前只有少量的口服制劑疫苗投入臨床使用。究其原因，疫苗通過口服免疫誘導(dǎo)強有力的保護性免疫反應(yīng)需要滿足以下條件：①將完整的活性抗原傳遞到腸道；②通過腸道黏膜屏障；③激活腸道粘膜的抗原提呈細胞[21]。然而，胃腸道復(fù)雜的理化環(huán)境讓以上的每一個條件都困難重重，在通過惡劣的胃環(huán)境并避免抗原被降解后，還需要足夠的劑量來激發(fā)機體免疫。這些都嚴重的限制了口服疫苗的大規(guī)模開發(fā)。

2.1 基于載體開發(fā)的口服疫苗設(shè)計思路 在口服疫苗的設(shè)計上的主流思想主要為以下三個：①使用合適載體載荷抗原。滿足條件的載體必須能夠有效的保護所載荷的抗原，并能夠在停留小腸的時間內(nèi)釋放疫苗，使抗原被提呈細胞(APC)提取跨越上皮層，才能夠達到穩(wěn)定有效地傳遞抗原的目的。②加入佐劑或者改善抗原的存在形式使其具有一定的佐劑作用。如果載體本身具有一定的佐劑能力最佳，可以增強疫苗所激發(fā)的免疫應(yīng)答[22]。③在不改變抗原活性的前提下，進一步增加抗原的免疫原性。關(guān)于運載工具的研究，主要集中在3種不同類型的載體上：基于顆粒的載體、腺病毒載體和基于脂質(zhì)的載體技術(shù)[23]。這些載體中的每一種都有不同的方法來提高抗原在其給藥時的功效。聚合物微顆粒(MPS)和納米粒子(NPs)作為顆粒類的抗體被廣泛應(yīng)用于疫苗載體的開發(fā)。因為聚合物顆粒能為所載荷的抗原如蛋白質(zhì)、DNA和多糖成分等提供有效的保護，防止抗原稀釋到胃腸道巨大的表面積上。顆粒除了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性外，還可以控制釋放部位，以改善穩(wěn)定抗原的傳遞。攜帶著抗原的納米粒子已證明可有效提高抗原的免疫原性，通過被動或主動的移動被APC攝取，以刺激細胞免疫和體液免疫反應(yīng)[24]。

2.2 轉(zhuǎn)基因植物疫苗的優(yōu)勢 植物細胞天然的細胞壁和獨特的顆粒樣蛋白存儲器等結(jié)構(gòu)剛好契合了口服疫苗載體的設(shè)計思路，在疫苗開發(fā)中具有巨大的潛力。1992年Mason等就提出了轉(zhuǎn)基因植物疫苗的概念，同時證明了植物細胞能夠?qū)ν庠吹鞍踪|(zhì)在細胞內(nèi)的進行正確的折疊和組裝[25]。已經(jīng)有部分實驗在動物模型中測試了轉(zhuǎn)基因植物細胞所產(chǎn)生抗原的免疫原性[26]。轉(zhuǎn)基因植物疫苗在口服途徑上的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下三點：①植物細胞的細胞壁的可以一定程度的保護抗原——也就是通常所說的“生物封裝效應(yīng)”——在通過胃液消化之后依然保持疫苗成分的結(jié)構(gòu)完整性，在到達小腸后，植物細胞壁被腸道寄居的微生物分解后，抗原才開始大量釋放。生物包封效應(yīng)降低了抗原的降解量，增加了GALT對抗原分子的生物利用度。②在植物中，尤其是在谷類作物種子中，存在著許多天然的顆粒樣蛋白存儲器，如淀粉顆粒和蛋白質(zhì)體等。蛋白質(zhì)體聚集了大量的重組融合蛋白[27]，這些植物顆粒具有類似佐劑樣作用，可提高抗原的攝取率。而顆粒形式的抗原通過增強B細胞受體交聯(lián)來促進更高水平的B細胞活化和內(nèi)化抗原靶向溶酶體，將抗原更有效的遞送給APC[28]。③蛋白質(zhì)糖基化的差異。聚糖可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)中的免疫原性活性，植物細胞與哺乳動物系統(tǒng)相比具有更大的差異糖基化，因此植物來源的抗原可能顯示出與其天然對應(yīng)物更強的免疫原性。事實上，這對于激素和抗體類的藥物是不希望有的特性，因為它會干擾所得藥品的相關(guān)活性。然而，在當作疫苗使用的情況下，植物聚糖可以增強巨噬細胞等對抗原的攝取，并可使抗原體現(xiàn)出更好的免疫原性[29]。

2.3 轉(zhuǎn)基因植物疫苗的局限性 不能精確地控制植物中轉(zhuǎn)基因的表達水平，是轉(zhuǎn)基因植物疫苗在投入臨床應(yīng)用之前存在的一項挑戰(zhàn)。目的蛋白質(zhì)在植物果實或者葉片中的濃度存在著巨大差異，這會在后期的食用時具體的用量上造成困擾。因為低劑量可能無法誘導(dǎo)足夠的免疫反應(yīng)，高劑量可能導(dǎo)致免疫耐受。雖然，目前可采用冷凍干燥方法來穩(wěn)定植物生物質(zhì)，濃縮抗原并通過以干燥生物質(zhì)重量定量抗原來獲得精確劑量，以及在疫苗制劑中摻入適當?shù)淖魟﹣泶龠M免疫應(yīng)答規(guī)避免疫耐受[30]。但是這與植物疫苗直接口服的目標還相距甚遠。

轉(zhuǎn)基因植物授粉期間的遺傳污染所引起的生態(tài)安全問題，也是當前研究中的另一項挑戰(zhàn)。迄今為止，疫苗抗原已被轉(zhuǎn)化到許多可食用的植物，包括生菜、番茄、馬鈴薯、木瓜、胡蘿卜、藜麥和煙草[31]。因此除了核基因組轉(zhuǎn)化之外，通過基因槍轟擊的方法將外源基因植入葉綠體基因組中作為新的替代技術(shù)出現(xiàn)了。葉綠體基因的嚴格的母系遺傳模式(即由細胞核外的染色體控制的遺傳現(xiàn)象)可以避免植物授粉期間的遺傳污染并消除轉(zhuǎn)化過程中的基因沉默。并且，葉綠體中外源基因具有較高水平的表達(可達總可溶性蛋白(TSP)的70%)[26]，而且，將疫苗抗原摻入葉綠體基因組中還可以使多個基因在單個操縱子中表達，這意味著開發(fā)葉綠體多價疫苗具有非常大的潛力。然而，轉(zhuǎn)入葉綠體基因組的方法也存在一些不利于其應(yīng)用的缺點。首先，葉綠體不適用于需要糖基化以及適當?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊的抗原。其次，抗原表達在植物葉片中主要是不穩(wěn)定的瞬時表達[32]。因此，在這方面還需要更進一步的研究。

2.4 與傳統(tǒng)疫苗的聯(lián)合使用 口服植物疫苗不僅可以單獨使用引起機體免疫反應(yīng)，也可與常規(guī)疫苗聯(lián)合使用，并通過調(diào)節(jié)常規(guī)疫苗的劑量和給藥方式，獲得不一樣的免疫效果。“初免-加強”的免疫方案的相關(guān)研究已證明可發(fā)揮出了較好的效果。即用常規(guī)疫苗或植物制備的純化抗原進行胃腸外免疫的方式引發(fā)免疫反應(yīng)，再通過較少的植物制劑口服后加強免疫應(yīng)答。有學(xué)者已經(jīng)在小鼠中評估了一種針對麻疹的口服植物疫苗，將其與相關(guān)的DNA疫苗組合應(yīng)用于初免-加強方案，發(fā)現(xiàn)用DNA疫苗引發(fā)的小鼠免疫后，再口服表達抗原的生菜凍干葉片加強免疫后，所顯示抗原特異性IgG滴度比單純使用DNA疫苗免疫的結(jié)果增加10倍[33]。此外，在滅活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗(IPV)誘導(dǎo)后，將基于脊髓灰質(zhì)炎VP1蛋白轉(zhuǎn)基因煙草生產(chǎn)的疫苗，作為實現(xiàn)有效粘膜免疫的方法，來加強免疫效果[34]。具體實驗方案為，在皮下給予IPV引發(fā)免疫的小鼠后，將以皂苷和角鯊烯作為佐劑的植物VP1疫苗，通過口服途徑提供短期加強，以誘導(dǎo)高度特異性粘膜免疫和全身性抗體免疫應(yīng)答。隨后每月口服植物疫苗加強，持續(xù)6個月，然后在1年后再單次加強。實驗結(jié)果表明，用植物制造的VP1疫苗可以產(chǎn)生IPV所不能誘導(dǎo)產(chǎn)生的粘膜免疫應(yīng)答，并誘導(dǎo)產(chǎn)生了持久有效的高水平的抗VP1-IgG、IgA和中和抗體滴度。

3 展望

新型冠狀病毒肺炎是全球關(guān)注的問題，接種疫苗是控制該病傳播的最有效的策略。截止2020年11月，我國已有13個針對新型冠狀病毒疫苗進入臨床試驗，其中共有4個疫苗進入Ⅲ期臨床試驗，共接種約6萬名受試者[35]。實際上，大多數(shù)病原體都是通過粘膜感染機體的。通過注射給藥的方式，在免疫方面具有一定的局限性。注射的疫苗不能夠引起粘膜反應(yīng)，而且它所激活的體液免疫與全身免疫力密切相關(guān)，這也就表明無法在感染的早期階段阻止病原體入侵。隨著對能夠觸發(fā)GALT并引起粘膜和全身體液免疫反應(yīng)口服疫苗研究的深入，許多臨床前研究和一些有前途的臨床試驗正在廣泛開展。像嵌合抗原受體等用于替代傳統(tǒng)抗生素和抗病毒藥的新方式，正在全世界各個實驗室努力研發(fā)中[36-37]。

轉(zhuǎn)基因植物疫苗的開發(fā)雖然具有巨大潛力，但目前FDA尚未批準可食用疫苗用于接種。需要更加詳細深入研究來剖析植物疫苗相關(guān)免疫原性的具體機制，以及更多的實驗來優(yōu)化疫苗制劑的設(shè)計。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及相應(yīng)的檢測手段的優(yōu)化，轉(zhuǎn)基因植物疫苗和抗體在工業(yè)化生產(chǎn)中具有廣泛的前景，而相關(guān)技術(shù)的進步也將有助于人們對轉(zhuǎn)基因植物疫苗進一步運用于人類疾病的防治。