李文杰 倪建秀 丁春暉 陳濤 陳桂芳

摘要 [目的]建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）同位素內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定青蝦中磺胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、酰胺醇類(lèi)4大類(lèi)27種獸藥殘留量的檢測(cè)方法。[方法]青蝦樣品經(jīng)86%（V/V）酸化乙腈（3%甲酸）-水溶液（含0.1 mol/L EDTA）提取后，提取液經(jīng)分散固相萃取法凈化，以UPLC-MS/MS測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。[結(jié)果]27種獸藥在各自線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R2≥0.99），磺胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、酰胺醇類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)的定量限分別為2.0、2.0、1.0、50.0 μg/kg，回收率在70.1%～110.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.2%～9.8%。[結(jié)論]該方法前處理簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、對(duì)環(huán)境友好，適用于青蝦中獸藥殘留的高通量快速檢測(cè)分析。

關(guān)鍵詞 QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;同位素內(nèi)標(biāo)法;獸藥殘留;青蝦

中圖分類(lèi)號(hào) TS254.7? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）24-0197-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.24.048

Simultaneous Determination of 27 Veterinary Drug Residues in Freshwater Shrimp by QuEChERS-UPLC-MS/MS

LI Wen-jie，NI Jian-xiu，DING Chun-hui et al （Quality Inspection Institute of Agricultural Products of Nanjing，Nanjing，Jiangsu 210036）

Abstract [Objective]To establish an ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） with isotope-labelled internal standard method，which was used to determine multiclass veterinary drugs residues simultaneously including sulfonamides，fluoroquinolones，tetracyclines and amphenicols in freshwater shrimp.[Method] The samples were extracted with 86% （V/V）acidified acetonitrile（3% formic acid）-water（containing 0.1 mol/L EDTA），then the extract was purified by dispersive solid phase extraction （DPSE）.The samples were determined by UPLC-MS/MS and quantified by internal standard method.[Result]27 kinds of veterinary drugs showed good linear relationship in their respective linear ranges （R2≥0.99）.The limits of quantification of sulfonamides，fluoroquinolones，amide alcohols and tetracyclines were 2.0，2.0，1.0，50.0 μg/kg，respectively.The recovery rates were 70.1%-110.0%.The relative standard deviations were 0.2%-9.8%.[Conclusion]The method is simple，accurate and environment-friendly，which is suitable for high-throughput rapid detection and analysis of veterinary drug residues in freshwater shrimp.

Key words QuEChERS-UPLC-MS/MS;Isotope internal standard method;Veterinary drug residue;Freshwater shrimp

基金項(xiàng)目

2018年度江蘇省第五期“333工程”科研項(xiàng)目（BRA2018121）。

作者簡(jiǎn)介 李文杰（1980—）， 男， 江蘇宜興人，高級(jí)工程師，碩士，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究。通信作者，高級(jí)工程師，碩士，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)工作。

收稿日期 2021-04-29

青蝦，學(xué)名日本沼蝦（Macrobrachium nipponense），是南京水產(chǎn)養(yǎng)殖的特色產(chǎn)業(yè)，養(yǎng)殖面積達(dá)4 666.67 hm2，產(chǎn)值超10億元，規(guī)模僅次于螃蟹，尤其是2019年開(kāi)始南京大面積推廣養(yǎng)殖生長(zhǎng)速度更快、抗病抗逆能力更強(qiáng)的新品種“太湖2號(hào)”，在科技創(chuàng)新、凈化水環(huán)境、富民增收等方面發(fā)揮著重要作用[1]。近年來(lái)養(yǎng)殖者反映青蝦出現(xiàn)散發(fā)性死亡[2]，需要合理使用獸藥，防治消化道細(xì)菌感染等疾病[3]。因此，獸藥殘留成為青蝦質(zhì)量安全的一個(gè)關(guān)注熱點(diǎn)。

目前，國(guó)內(nèi)外動(dòng)物性產(chǎn)品中獸藥殘留檢測(cè)的前處理方法主要有固相萃取法、QuEChERS法、基質(zhì)固相分散萃取法等[4-6]，檢測(cè)方法主要有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-8]，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）因具有高靈敏度、高選擇性的優(yōu)勢(shì)已被廣泛用于獸藥多殘留分析[9]，因此在青蝦樣品中同時(shí)檢測(cè)磺胺類(lèi)12種、氟喹諾酮類(lèi)8種、酰胺醇類(lèi)3種、四環(huán)素類(lèi)4種計(jì)27種獸藥多殘留測(cè)定具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試材

ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜儀（Waters公司）;QTRAP 5500質(zhì)譜儀（SCIEX公司）;BP211D電子天平（賽多利斯公司）;KS501振蕩器（IKA公司）;AllegraX-30R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（貝克曼公司）;MS3渦旋混合器（IKA公司）;MV5全自動(dòng)平行濃縮儀（萊伯泰科公司）。27種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品和10種同位素內(nèi)標(biāo)（德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，純度>99.8%）;乙腈為色譜純（TEDIA公司）;乙酸銨為色譜純（美國(guó)Sigma-aldrich公司）;40～63 μm PSA、40～63 μm C18凈化劑、甲酸，均為色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司;乙二胺四乙酸（EDTA）、無(wú)水硫酸鈉，均為分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司;實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水。

青蝦樣品為南京市地產(chǎn)例行監(jiān)測(cè)樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 獸藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別精密稱(chēng)取各獸藥標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20? ℃保存。

1.2.1.2 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。分別精密稱(chēng)取各獸藥內(nèi)標(biāo)適量，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于-20? ℃保存。

1.2.2 獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別吸取適量獸藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100 μg/mL），用甲醇配制成中間液，再分別吸取2.00 mL磺胺類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)中間液（2.0 μg/mL）、2.00 mL氟喹諾酮類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)中間液（2.0 μg/mL）、4.00 mL酰胺醇類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.0 μg/mL）、10.00 mL四環(huán)素類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 μg/mL）置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻，置于-20? ℃冰箱保存?；前奉?lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、酰胺醇類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)獸藥的質(zhì)量濃度分別為80、80、40和2 000 μg/L。

1.2.2.2 混合內(nèi)標(biāo)使用液。分別吸取5.00 mL磺胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、酰胺醇類(lèi)內(nèi)標(biāo)中間液（10 μg/mL）和5.00 mL四環(huán)素類(lèi)內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（100 μg/mL）置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻，置于-20? ℃冰箱保存，內(nèi)標(biāo)工作液的質(zhì)量濃度磺胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、酰胺醇類(lèi)均為1.0 μg/L，四環(huán)素類(lèi)為10.0 μg/L。

1.2.3 獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液。吸取適量27種獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)使用液和混合內(nèi)標(biāo)使用液，用初始流動(dòng)相稀釋?zhuān)前奉?lèi)和氟喹諾酮類(lèi)質(zhì)量濃度為20～400 μg/L，四環(huán)素類(lèi)質(zhì)量濃度為50～800 μg/L，酰胺醇類(lèi)質(zhì)量濃度為1～200 μg/L，于4 ℃條件保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1 采樣和試樣制備。抽取有代表性的青蝦樣品，至少取10尾清洗后[10]，去蝦頭、蝦皮，得到整條蝦肉絞碎混合均勻備用，試樣量為400 g。

1.3.2 提取。

稱(chēng)取2.00 g試樣于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液，加入1.0 mL水和0.4 mL 0.1 mol/L EDTA溶液，混勻1 min后再加入8.6 mL 3%酸化乙腈，于渦旋混合器上混合1 min后振蕩20 min，以4 ℃、10 000 r/min 離心5 min，取上清液。

1.3.3 凈化。

取5.0 mL上清液，加入DSPE混合凈化劑（50 mg PSA+150 mg C18+900 mg無(wú)水硫酸鈉），渦旋30 s后，4 000 r/min離心10 mim，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.4.1 液相色譜條件。色譜柱為ACQUITY UPLC CSH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），前端連接ACQUITY UPLC CSH保護(hù)柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）。流動(dòng)相A為2 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。梯度洗脫程序?yàn)?.1～2.0 min，3%B～15%B;2.0～5.0 min，15%B～22%B;5.0～11.0 min，22%B～25%B;11.0～12.0 min，25%B～30%B;12.0～13.0 min，30%B～35%B;13.0～13.5 min，35%B～80%B;13.5～16.0 min，80%B～90%B;16.0～16.1 min，90%B～3%B;16.1～18.0 min維持3%B。流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，流路在1.0～16.0 min進(jìn)入質(zhì)譜，在1.0 min之前和16.0 min之后切向廢液，柱溫為40 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件。

電噴霧離子源ESI;1.0～2.5、5～16 min進(jìn)行正離子模式掃描，2.5～5.0 min進(jìn)行負(fù)離子模式掃描（氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考-D3、氯霉素-D5）;霧化氣壓力為413.7 kPa，氣簾氣壓力為206.8 kPa，輔助加熱氣壓力為344.7 kPa，碰撞氣設(shè)置為Medium，以上4種氣體均為氮?dú)?離子源溫度為600? ℃;正離子化電壓為4 500 V;負(fù)離子化電壓為-4 500 V;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）采集模式;其他參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 提取劑的優(yōu)化。

獸藥多殘留分析所選用的溶劑包括乙腈-水-緩沖液、乙腈-水-酸、甲醇-水-酸等溶劑，甲醇提取時(shí)會(huì)帶入更多的極性基質(zhì)干擾物，且蛋白沉淀松散，增加后續(xù)凈化難度[11]。因EDTA是一種良好的螯合劑，不僅能夠有效分散基質(zhì)，還能競(jìng)爭(zhēng)性地去除基質(zhì)中存在的金屬離子，使四環(huán)素和部分氟喹諾酮類(lèi)化合物游離出來(lái)，在EDTA與無(wú)機(jī)離子螯合釋放出四環(huán)素后，利用一些酸化劑來(lái)調(diào)節(jié)體系的pH可以更進(jìn)一步地促進(jìn)四環(huán)素的提取效率[12]，另外，EDTA的弱電離性也能促進(jìn)體系的電離平衡，抑制溶液中的酸性離子對(duì)磺胺類(lèi)化合物的沖擊[13]。因酸度過(guò)量時(shí)，大部分磺胺類(lèi)待測(cè)物都會(huì)發(fā)生一定程度的損失，降低提取效率[12-13]。故該試驗(yàn)選擇先加入1.0 mL水和0.4 mL 0.1 mol/L EDTA溶液，混勻1 min后再加入8.6 mL甲酸乙腈混勻1 min，250 r/min 振蕩20 min提取，4種提取試劑組成見(jiàn)表2，比較不同提取溶劑對(duì)獸藥回收率的影響。

通過(guò)單因素方差分析，結(jié)果顯示，在α=0.05水平上，四環(huán)素類(lèi)差異顯著，不同提取溶劑回收率見(jiàn)圖1，提取試劑3回收率在70.1%～119.0%，而磺胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、酰胺醇類(lèi)差異不顯著，回收率分別為45.0%～120.0%、40.0%～162.5%、72.0%～109.5%，因此，該方法最終選擇提取試劑3，即86%（V/V）酸化乙腈（3%甲酸）-水溶液（含0.1 mol/L EDTA）。

2.1.2 凈化方法的選擇及條件的優(yōu)化。該研究比較了MAS-Q NANO、DSPE混合凈化劑（PSA+C18+無(wú)水硫酸鈉）和Cleanert LipoNo這3種凈化試劑對(duì)去除色素和降低基質(zhì)干擾的效果，結(jié)果顯示，采用LipoNo凈化后目標(biāo)分析物干擾峰較多，且上機(jī)液顏色較深，而DSPE混合凈化劑在色素和基質(zhì)干擾方面效果良好，NANO和LipoNo最佳提取凈化的條件還有待進(jìn)一步研究。

2.1.3 定性與定量方法的選擇。

在相同的質(zhì)譜條件下，將樣品質(zhì)譜圖與基質(zhì)加標(biāo)質(zhì)譜圖進(jìn)行對(duì)照，樣品保留時(shí)間與基質(zhì)加標(biāo)陽(yáng)性樣品保留時(shí)間相對(duì)偏差在5%以?xún)?nèi)，且檢測(cè)的離子相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)?shù)男Ｕ龢?biāo)準(zhǔn)品相對(duì)豐度一致。基峰與次強(qiáng)碎片離子豐度比符合相關(guān)要求，最終確定樣品中的獸藥殘留。因同位素內(nèi)標(biāo)法更適用于測(cè)定藥物中微量組分或雜質(zhì)的含量，且能避免試驗(yàn)前處理操作中的目標(biāo)成分丟失造成的定量不準(zhǔn)確，降低基質(zhì)效應(yīng)，該研究選擇了內(nèi)標(biāo)法定量，各目標(biāo)物定量對(duì)應(yīng)的氘代化合物見(jiàn)表3。

2.2 獸藥基質(zhì)加標(biāo)質(zhì)譜圖 按“1.4”色譜質(zhì)譜條件，分別對(duì)27種獸藥加標(biāo)樣品進(jìn)行測(cè)定，27種獸藥50 ng/mL基質(zhì)加標(biāo)質(zhì)譜圖如圖2所示。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

以標(biāo)準(zhǔn)系列峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比對(duì)其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸分析，以10倍信噪比計(jì)算定量限（LOQ）。結(jié)果表明，27種獸藥在各自線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，且決定系數(shù)（R2）大于0.99（表1），磺胺類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、酰胺醇類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)的LOQ分別為2.0、2.0、1.0和50.0 μg/kg（表4）。

2.4 回收率和精密度

在青蝦空白基質(zhì)中分別添加3個(gè)濃度水平的獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)添加濃度重復(fù)6次，計(jì)算添加回收率和測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。從表4

可以看出，在LOQ、2LOQ、5LOQ 3個(gè)加標(biāo)水平上，磺胺類(lèi)平均回收率在71.4%～110.0%，RSD在0.2%～9.4%;氟喹諾酮類(lèi)平均回收率在75.9%～109.8%，RSD在2.0%～9.6%;酰胺醇類(lèi)平均回收率在84.3%～108.3%，RSD在3.2%～7.7%;四環(huán)素平均回收率在70.1%～109.0%，RSD在0.2%～9.8%;符合化學(xué)分析方法驗(yàn)證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制要求中關(guān)于正確度和精密度的要求[14]。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定 將該方法應(yīng)用于檢測(cè)40批次青蝦中27種獸藥殘留，結(jié)果檢出恩諾沙星樣品3份，殘留量在24.7～70.8 μg/kg;用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 21312—2007[15]測(cè)定，結(jié)果一致。

3 結(jié)論

該研究建立了青蝦中4類(lèi)共27種獸藥QuEChERS凈化的樣品前處理和UPLC-MS/MS同位素內(nèi)標(biāo)法，與國(guó)標(biāo)方法相比，實(shí)現(xiàn)了多獸藥殘留同時(shí)檢測(cè)。采用3個(gè)加標(biāo)水平的獸藥對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果穩(wěn)定，能滿足日常檢測(cè)工作需要。

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