樊 嘉

全世界每年新發(fā)肝細(xì)胞癌(簡稱肝癌)的病例中約一半發(fā)生在我國，因此，我國是“肝癌大國”。手術(shù)切除是目前最主要的肝癌根治性治療方式，也是最有效的治療方法。肝癌切除術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)70%，其中多數(shù)發(fā)生于手術(shù)后2年內(nèi)(即早期復(fù)發(fā))，嚴(yán)重影響了肝癌患者的長期生存和生活質(zhì)量[1]。早期復(fù)發(fā)肝癌多由原發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞在肝內(nèi)播散形成，晚期復(fù)發(fā)肝癌則常起源于殘余肝臟的新發(fā)病灶。相較于晚期復(fù)發(fā)，早期復(fù)發(fā)的肝癌進(jìn)展更快，治療效果不佳，患者預(yù)后更差。因此，揭示肝癌早期復(fù)發(fā)的機(jī)制，以此為基礎(chǔ)探索早期復(fù)發(fā)肝癌綜合防治的新策略，是進(jìn)一步提高肝癌療效和改善我國肝癌患者總體預(yù)后的關(guān)鍵課題。

越來越多的研究結(jié)果提示，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展不是一個孤立事件，在腫瘤演進(jìn)過程中，始終伴隨著實(shí)質(zhì)細(xì)胞與免疫微環(huán)境的相互作用。免疫系統(tǒng)識別并殺傷腫瘤細(xì)胞，而腫瘤通過各種方式逃脫免疫監(jiān)視，如降低免疫原性、誘導(dǎo)免疫耐受、促進(jìn)免疫抑制、形成物理屏障。免疫治療通過阻斷腫瘤的免疫逃逸機(jī)制，恢復(fù)免疫細(xì)胞的殺傷功能，為治療甚至治愈腫瘤提供了新思路。原發(fā)肝癌中的效應(yīng)性CD8+胸腺依賴淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)較少，耗竭性CD8+T細(xì)胞占多數(shù)[2]。兩項Ⅲ期臨床試驗的結(jié)果已表明，免疫檢查點(diǎn)抑制劑單用(KEYNOTE-240臨床試驗)[3]或者聯(lián)合使用抗血管生成藥物(IMbrave150臨床試驗)[4]，均能使晚期肝癌患者獲益，延長其生存時間。然而，從腫瘤最初形成到發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用是動態(tài)變化的，不同時期腫瘤免疫逃逸機(jī)制可能并不相同[5]。早期復(fù)發(fā)肝癌與原發(fā)肝癌免疫微環(huán)境的差異，將會影響免疫治療方式的選擇。以下通過介紹早期復(fù)發(fā)肝癌的微環(huán)境特征，以及免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相互作用的機(jī)制，以期為制訂早期復(fù)發(fā)肝癌的免疫治療新策略提供理論依據(jù)。

1 原發(fā)肝癌的非主要克隆更具復(fù)發(fā)優(yōu)勢

早期復(fù)發(fā)肝癌與原發(fā)肝癌同源，全外顯子測序提示兩者共有突變的比例為27%～49%，高于非同源腫瘤；單細(xì)胞DNA數(shù)據(jù)進(jìn)一步揭示，早期復(fù)發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞來源于原發(fā)灶的非主要克隆[6]。絕大多數(shù)患者的原發(fā)肝癌中至少有1個主要克隆，在配對復(fù)發(fā)灶中幾近消失[7]。復(fù)發(fā)肝癌丟失原發(fā)肝癌的主要克隆是普遍現(xiàn)象。由于復(fù)發(fā)灶中的多數(shù)CD8+T細(xì)胞與原發(fā)灶中CD8+T細(xì)胞識別相同的抗原[6]，原發(fā)灶的非主要克隆可能因新抗原暴露少，不被CD8+T細(xì)胞識別而逃脫免疫清除，進(jìn)一歩形成復(fù)發(fā)灶。因此，使用靶向新抗原的方法治療早期復(fù)發(fā)肝癌時，不應(yīng)遺漏更具復(fù)發(fā)優(yōu)勢的非主要克隆。

2 早期復(fù)發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞逃逸免疫

原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)的信號通路呈活化狀態(tài)，而復(fù)發(fā)灶腫瘤細(xì)胞則激活免疫監(jiān)視和逃逸相關(guān)信號通路。在復(fù)發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞中，免疫逃逸相關(guān)基因CD47基因的表達(dá)量增高，可能抑制樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)的成熟和抗原呈遞，抵抗巨噬細(xì)胞的識別和吞噬，減少新抗原的釋放；人類淋巴細(xì)胞抗原A、B、C的表達(dá)量增高，表明其對自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞死亡的抵抗力增加。在免疫檢查點(diǎn)配體基因中，原發(fā)灶和復(fù)發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞低表達(dá)重組人半乳糖凝集素9[LGALS9，T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3(TIM-3)的配體]、TNF受體超家族成員14[TNFRSF14，B和T細(xì)胞相關(guān)蛋白(BTLA)的配體]、程序性細(xì)胞死亡受體1配體2[PDCD1LG2，程序性細(xì)胞死亡受體1(PD-1)的配體]和含有V-Set結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞激活抑制劑1[VTCN1，程序性細(xì)胞死亡1配體1(B7-H1)的配體]，高表達(dá)纖維蛋白原樣蛋白1[FGL1，淋巴細(xì)胞激活基因3(LAG3)的配體]。此外，復(fù)發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(CTLA4)、CD274[程序性細(xì)胞死亡受體1配體1(PD-L1)]表達(dá)量和CD274陽性細(xì)胞比例均高于原發(fā)灶?？笴D47的療法或者多種免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合的療法，可能有助于防治早期復(fù)發(fā)肝癌。

3 早期復(fù)發(fā)灶的CD8+T細(xì)胞多而失能

就浸潤T細(xì)胞的所占比例而言，早期復(fù)發(fā)肝癌呈獨(dú)特的免疫微環(huán)境特征，如CD8+T細(xì)胞比例增高，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)減少。此外，復(fù)發(fā)灶中增殖性和克隆擴(kuò)增T細(xì)胞的比例降低亦提示免疫狀態(tài)相對靜止。

從免疫狀態(tài)和細(xì)胞轉(zhuǎn)變方面來看，原發(fā)灶與復(fù)發(fā)灶的CD8+T細(xì)胞的分化軌跡相同，但免疫狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)明顯不同。相同的分化軌跡是指腫瘤內(nèi)的浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞呈現(xiàn)出順序變化的連貫狀態(tài)，均存在早期狀態(tài)、中間細(xì)胞毒性狀態(tài)和終末耗竭性狀態(tài)。不同的是，原發(fā)灶的CD8+T細(xì)胞多數(shù)處于中間細(xì)胞毒性狀態(tài)和終末耗竭性狀態(tài)，而復(fù)發(fā)灶的CD8+T細(xì)胞以早期狀態(tài)為主，處于終末耗竭性狀態(tài)者很少。復(fù)發(fā)灶中，早期狀態(tài)CD8+T細(xì)胞的代謝依賴于脂肪酸氧化和有氧糖酵解，而不是氧化磷酸化，表明其能量代謝過程類似于記憶細(xì)胞，而不同于經(jīng)典的幼稚細(xì)胞[8-9]。早期狀態(tài)CD8+T細(xì)胞的CD45可變剪接更傾向于CD45RO而非CD45RA，也表明其并非幼稚狀態(tài)，而是在先前已被激活。早期狀態(tài)CD8+T細(xì)胞中上調(diào)的表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白1(FoxP1)，可使CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出無反應(yīng)性特征，可介導(dǎo)TGF-β誘導(dǎo)的c-JUN蛋白轉(zhuǎn)錄抑制，維持記憶性T細(xì)胞的生存[10-11]。因此，復(fù)發(fā)肝癌中富集的CD8+T細(xì)胞呈記憶性和非殺傷狀態(tài)。

相較于原發(fā)灶，早期復(fù)發(fā)灶中CD8+T細(xì)胞的組織駐留基因水平升高，抑制性和細(xì)胞毒性信號減弱，表明其處于低活化狀態(tài)而非耗竭狀態(tài)。復(fù)發(fā)灶中CD8+T細(xì)胞上調(diào)KLRB1(CD161)和IL受體(7IL7R)，表現(xiàn)出固有免疫樣和記憶性T細(xì)胞表型[12]。殺傷細(xì)胞凝集素樣受體G1(KLRG1)、自然細(xì)胞毒性觸發(fā)受體3(NCR3)和RAR相關(guān)孤兒受體(RORA)的表達(dá)量增高，亦表明存在2型固有免疫樣淋巴樣細(xì)胞(ILC2)表型[13]。免疫組織化學(xué)檢查證實(shí)，復(fù)發(fā)灶中CD161+CD8+T細(xì)胞富集，且與二次復(fù)發(fā)顯著相關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗證實(shí)，CD161+CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性弱于CD8+CD161-T細(xì)胞。在KLRB1高表達(dá)CD8+T細(xì)胞中富集的基因集，能夠提示肝癌患者預(yù)后不良。

與原發(fā)灶CD8+T細(xì)胞的衰竭狀態(tài)不同，復(fù)發(fā)灶中以KLRB1過表達(dá)為特征的CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出固有免疫樣、低細(xì)胞毒性和非耗竭表型。對于原發(fā)肝癌和復(fù)發(fā)肝癌，應(yīng)考慮采用不同的免疫療法。CD161+CD8+T細(xì)胞無法識別并攻擊復(fù)發(fā)腫瘤，通過化學(xué)治療或靶向治療誘導(dǎo)復(fù)發(fā)肝癌釋放新抗原，可能會激活未成熟的CD8+T細(xì)胞，引起復(fù)發(fā)肝癌特異性CD8+T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增。

4 早期復(fù)發(fā)灶DC抗原遞呈受抑制

復(fù)發(fā)灶中DC的富集程度高于原發(fā)灶和復(fù)發(fā)灶癌旁組織，可以聚類為DC1[高表達(dá)包含9A的C型凝集素結(jié)構(gòu)域(CLEC9A)]、DC2[高表達(dá)分化簇1C(CD1C)、含有10A的C型凝集素結(jié)構(gòu)域(CLEC10A)]和DC3[高表達(dá)C-C基序趨化因子配體(CCL19)、溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白3(LAMP3)、C-C基序趨化因子受體(CCR7)]。DC2可向CD4+T細(xì)胞遞呈特異性抗原，但無法向CD8+T細(xì)胞遞呈。DC3細(xì)胞具有遷移至淋巴結(jié)的能力，可能是腫瘤特異性的DC亞群。在3個DC細(xì)胞亞群中，僅DC2在復(fù)發(fā)灶中顯著富集。

DC細(xì)胞原本應(yīng)發(fā)揮抗原遞呈作用，增強(qiáng)適應(yīng)性免疫。然而在復(fù)發(fā)灶中，腫瘤細(xì)胞可能通過PD-L1-CD80和CTLA4-CD80與DC(DC2或DC3)相互作用，競爭性抑制DC與T細(xì)胞CD80-CD28的相互作用(CD80對PD-L1和CTLA4的親和力高于對CD28的親和力[14])，進(jìn)而抑制DC的抗原呈遞作用，降低T細(xì)胞的活化效率，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。多重免疫熒光實(shí)驗也證實(shí)，CD80+CD1c+DC位于PD-L1陽性復(fù)發(fā)肝癌細(xì)胞附近。除了直接作用，肝癌細(xì)胞還可釋放PD-L1外泌體，進(jìn)一步削弱抗腫瘤免疫[15]。恢復(fù)DC抗原遞呈功能可能是治療早期復(fù)發(fā)肝癌潛在有效的策略。

5 結(jié) 論

早期復(fù)發(fā)肝癌較原發(fā)肝癌有其獨(dú)特的免疫微環(huán)境，其特征為免疫抑制細(xì)胞Treg的比例降低，DC細(xì)胞和固有免疫樣CD161+CD8+T細(xì)胞的比例增高，T細(xì)胞的細(xì)胞毒性降低和功能失調(diào)。復(fù)發(fā)肝癌細(xì)胞與浸潤免疫細(xì)胞間相互作用，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。多種免疫治療聯(lián)合使用是治療早期復(fù)發(fā)肝癌最有效的策略，促進(jìn)新抗原釋放，阻斷腫瘤細(xì)胞所致的免疫抑制，恢復(fù)CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤作用，實(shí)現(xiàn)“1+1>2”治療效果。合適的聯(lián)合治療策略、提示治療效果的標(biāo)志物，以及輔助治療預(yù)防復(fù)發(fā)的價值，是肝癌免疫治療領(lǐng)域需要關(guān)注的問題。