黃鑫悅，晁旭，黃峰

1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽(yáng) 712000；2 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院科研科

原發(fā)性肝癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，肝細(xì)胞癌（HCC）是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌，同時(shí)也是全球第六大最常見(jiàn)的癌癥［1］。原發(fā)性肝癌的主要治療手段包括手術(shù)治療（肝切除術(shù)或肝移植術(shù)）、經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（TACE）以及局部消融療法等。大多數(shù)原發(fā)性肝癌患者確診時(shí)已為中晚期，難以進(jìn)行手術(shù)治療［1］。原發(fā)性肝癌已經(jīng)嚴(yán)重危害全世界人民的生命健康和生活質(zhì)量，因此臨床亟需改進(jìn)治療方法以延長(zhǎng)患者的生存期和提高其生活質(zhì)量。近年來(lái)，腫瘤免疫療法因其卓越的有效性和安全性逐漸受到了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。嵌合抗原受體T 細(xì)胞（CAR-T 細(xì)胞）療法首次應(yīng)用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤，取得了令人鼓舞的結(jié)果［2］，同時(shí)，其在實(shí)體腫瘤治療的應(yīng)用中也展現(xiàn)出積極的效果，顯示出CAR-T 細(xì)胞治療巨大的潛力和發(fā)展前景。隨著基礎(chǔ)研究的深入、治療理念的更新，已有研究將CAR-T細(xì)胞治療應(yīng)用于肝轉(zhuǎn)移瘤［3］?，F(xiàn)就CAR-T結(jié)構(gòu)與發(fā)展、肝細(xì)胞癌相關(guān)腫瘤抗原及CAR-T細(xì)胞治療存在的問(wèn)題和解決策略等進(jìn)行綜述，為原發(fā)性肝癌的治療提供新思路。

1 CAR-T概述

CAR-T 細(xì)胞是提取的自體或同種異體T 細(xì)胞，經(jīng)基因修飾后表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體——表面無(wú)限制的抗原特異性受體，回輸后能夠識(shí)別和攻擊帶抗原的腫瘤細(xì)胞。嵌合抗原受體（CAR）的結(jié)構(gòu)分為三部分：胞外抗原結(jié)合區(qū)的單鏈片段變量（scFv）、跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)。跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)連接胞外抗原結(jié)合區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，在傳遞T 細(xì)胞活化過(guò)程中起重要作用，由CD4、CD8或CD28等構(gòu)成；胞內(nèi)信號(hào)區(qū)可發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)功能，由合TCR/CD3 的ζ 鏈、免疫球蛋白Fc受體（FcεRI）的γ鏈構(gòu)成［4］。

目前，CAR 的發(fā)展可分為四代。第一代是一種與T 細(xì)胞激活信號(hào)區(qū)的胞外單鏈抗體和CD3ζ 鏈相連的融合蛋白，但細(xì)胞缺乏長(zhǎng)期存活和旺盛的增殖能力。 因此，可以通過(guò)將共刺激內(nèi)域分子引入CD3CD3ζ，如4-1BB 和（或）CD28，使CAR-T 細(xì)胞在體內(nèi)的持久性和抗腫瘤能力得到顯著提高。由于第一代CAR的臨床活性有限，第二代和第三代CAR添加了一到兩個(gè)共刺激分子，如CD27、CD28、CD134（OX40）和CD137（4-1BB），以產(chǎn)生持久的T 細(xì)胞擴(kuò)張和持續(xù)的抗腫瘤作用。第四代CAR 對(duì)其結(jié)構(gòu)的探索又向前邁進(jìn)了一步，在原有結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上增加了編碼載體，以誘導(dǎo)相應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)，并增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的其他效應(yīng)物，以便在免疫抑制的腫瘤微環(huán)境中釋放細(xì)胞因子，招募和激活更多的免疫細(xì)胞，增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性［4］。

CAR-T細(xì)胞治療的技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)是相關(guān)腫瘤抗原的選擇，靶點(diǎn)優(yōu)先選擇正常組織中表達(dá)不顯著的腫瘤特異性抗原。研究表明，以磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）為靶點(diǎn)的CAR-T 細(xì)胞療法也可能是一種潛在的肝癌治療方法［6］。最近一項(xiàng)研究構(gòu)建了一種CAR（HYP7）T 細(xì)胞模型，該模型能夠通過(guò)誘導(dǎo)穿孔素和顆粒酶介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡或減少腫瘤細(xì)胞中的Wnt 信號(hào)來(lái)消除GPC3 陽(yáng)性的HCC 細(xì)胞，強(qiáng)調(diào)了針對(duì)GPC3 的CAR-T 細(xì)胞治療在肝癌患者治療中的潛力［7］。因此，選擇原發(fā)性肝癌的相關(guān)靶點(diǎn)至關(guān)重要，原發(fā)性肝癌相關(guān)新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)可能會(huì)更好地促進(jìn)CAR-T 細(xì)胞治療發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，但在應(yīng)用于臨床治療之前，仍需要大量的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)驗(yàn)證。

2 肝細(xì)胞癌相關(guān)腫瘤抗原

運(yùn)用免疫療法治療原發(fā)性肝癌的方法已經(jīng)過(guò)多年的測(cè)試，運(yùn)用基于抗體或細(xì)胞因子的方法，大多數(shù)雖已被證實(shí)其安全性，并且可以成功誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，但并不能體現(xiàn)出確切的臨床效果［8］。目前與原發(fā)性肝癌相關(guān)的腫瘤抗原包括GPC3、紐約食管鱗狀上皮癌抗原-1（NY-ESO-1）、MUC-1、上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）、甲胎蛋白（AFP）、c-MET等。

2.1 GPC3 GPC3 具有前所未有的癌癥特異性，目前正作為全球癌癥免疫治療的靶點(diǎn)被研究。GPC3在HCC、卵巢透明細(xì)胞癌、黑色素瘤、肺鱗狀細(xì)胞癌、肝母細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤（Wilms腫瘤）、卵黃囊腫瘤中特異性表達(dá)。GPC3 通過(guò)結(jié)合Wnt、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子等生長(zhǎng)因子來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖信號(hào)，在胚胎細(xì)胞的增殖和分化中發(fā)揮重要作用，同時(shí)可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［7］。GAO 等［6］研究表明，GPC3靶向的CAR-T細(xì)胞在體外可有效殺傷GPC3陽(yáng)性肝癌細(xì)胞，而對(duì)GPC3 陰性肝癌細(xì)胞無(wú)殺傷作用。JIANG等［9］采用原代HCC細(xì)胞建立異種移植模型，將CAR-T 細(xì)胞過(guò)繼移植到患者源性HCC 異種移植（PDX）模型中，結(jié)果表明，GPC3-CAR-T 細(xì)胞能夠有效消除HCC PDX模型中的腫瘤。因此，PDX模型有可能用于評(píng)估GPC3-CAR-T細(xì)胞治療個(gè)體肝癌的療效，GPC3-CAR-T細(xì)胞治療是HCC治療有希望的候選者。

2.2 NY-ESO-1 NY-ESO-1 在惡性腫瘤中的高表達(dá)和高頻率表達(dá)，以及其誘導(dǎo)有效整合的能力，使其成為具有動(dòng)態(tài)潛力的免疫治療靶點(diǎn)。研究表明，NY-ESO-1的表達(dá)與肝癌手術(shù)后較差的預(yù)后相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)的機(jī)制可能是NY-ESO-1 促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移［10］；NY-ESO-1是HCC 的預(yù)后標(biāo)志物，NY-ESO-1的表達(dá)越高，HCC復(fù)發(fā)的可能性越大［11］。

2.3 MUC-1 MUC-1是一種與腫瘤相關(guān)的標(biāo)志物，表達(dá)于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、肝癌和胰腺癌中。該腫瘤相關(guān)跨膜分子的主要細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域由20個(gè)氨基酸的串聯(lián)重復(fù)單元（PDTRPAPGSTAP?PAHGVTSA）組成，其核心蛋白也被異常糖基化，使得與腫瘤相關(guān)的粘蛋白在抗原上不同于正常粘蛋白。FENG等［12］評(píng)估了MUC-1對(duì)HCC細(xì)胞放射抗性的可能影響及其潛在機(jī)制，MUC-1 介導(dǎo)的針對(duì)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)，與JAK2/STAT3 信號(hào)通路的激活以及抗細(xì)胞凋亡蛋白Mcl-1 和Bcl-xL 的誘導(dǎo)有關(guān)。MA 等［13］構(gòu)建了兩種特異性靶向MUC-1 的Jurkat CAR-T 細(xì)胞（1 代和3 代），其均可特異性殺傷MUC-1過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞。

2.4 EpCAM EpCAM 是一種跨膜糖蛋白。EpCAM+HCC 細(xì)胞顯示出肝干細(xì)胞樣特征，包括自我更新和分化，這決定了HCC 的生長(zhǎng)和侵襲性。EpCAM 在HCC 中的表達(dá)與HCC 的不良預(yù)后有關(guān)，提示EpCAM 可作為危險(xiǎn)分層的潛在生物標(biāo)志物。表達(dá)EpCAM 的PDC 可能是HCC 的細(xì)胞起源，PDC衍生的HCC 顯示伴隨CLC 成分的組織學(xué)特征，并伴隨Wnt信號(hào)的激活，炎癥條件下肝臟中EpCAM-PDC的異常增殖可能與肝癌的發(fā)病有關(guān)［14］。

2.5 AFP AFP 具有一系列重要的生理功能，包括轉(zhuǎn)運(yùn)功能、免疫抑制、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。AFP在肝癌中高度表達(dá)，使其成為CAR-T 細(xì)胞治療的理想靶點(diǎn)。LIU 等［15］發(fā)現(xiàn)，在已建立的腹腔肝癌異種移植模型中，AFP-CAR-T 細(xì)胞顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤活性，并且可以選擇性脫粒，釋放細(xì)胞因子，并裂解肝癌細(xì)胞。SHAO 等［16］對(duì)晚期肝癌患者進(jìn)行AFP 應(yīng)答評(píng)估，探討AFP 水平的下降是否與晚期肝癌患者免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIS）的治療結(jié)果有關(guān)，發(fā)現(xiàn)早期AFP 應(yīng)答者的客觀有效率（73%）顯著高于早期無(wú)應(yīng)答者（14%），可見(jiàn)早期AFP 應(yīng)答與ICIS 對(duì)晚期肝癌的較高療效相關(guān)。

2.6 c-MET c-MET 是一種由MET 原癌基因編碼的酪氨酸激酶受體，主要在上皮和內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、肝細(xì)胞和造血細(xì)胞中表達(dá)。目前，一些用于治療肝癌的c-MET 抑制劑正在研究中，如施坦替尼、INC280 和卡波贊替尼等［17］。 有研究結(jié)合CAR-T細(xì)胞治療和免疫檢查點(diǎn)設(shè)計(jì)針對(duì)c-MET 和PD-L1的CAR-T 細(xì)胞表明，雙重靶向CAR-T 細(xì)胞對(duì)c-MET+PD-L1+HCC細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性［18］。

2.7 CD133 CD133 是一種五聚糖跨膜糖蛋白，在肝癌、腦瘤、肺癌和胰腺癌中高度表達(dá)。研究表明，CD133 水平升高的肝癌患者總體存活率較低，復(fù)發(fā)率較高。WANG 等［19］建立了CD133 特異性的CART-133 修飾T 細(xì)胞（CAR-T-133），發(fā)現(xiàn)CAR-T-133 細(xì)胞具有明顯的裂解能力，對(duì)CD133+細(xì)胞產(chǎn)生更高的細(xì)胞因子，并能顯著抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)；與其他組相比，腫瘤組織中CAR 基因的復(fù)制水平更高。CHEN 等［20］通過(guò)Meta 分析指出，CD133 在肝癌患者中呈現(xiàn)顯著表達(dá)，并且與患者的總生存率和無(wú)腫瘤生存率呈負(fù)相關(guān)。

3 影響CAR-T細(xì)胞治療原發(fā)性肝癌的因素和解決策略

3.1 CAR-T 細(xì)胞治療原發(fā)性肝癌的影響因素 免疫細(xì)胞輸注的毒副作用和肝臟的免疫抑制微環(huán)境是CAR-T 在原發(fā)性肝癌治療中應(yīng)用的潛在重要障礙。CAR-T細(xì)胞需要被運(yùn)輸并滲透到腫瘤部位才能發(fā)揮其殺細(xì)胞作用。靜脈注射是將CAR-T 細(xì)胞重新注入血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者體內(nèi)的有效途徑。通過(guò)靜脈輸注的CAR-T 細(xì)胞與血管中的血液一起輸入，但很少滲透到肝腫瘤部位，甚至可能?chē)?yán)重?fù)p害其他正常器官。由肝纖維化和肝硬化發(fā)展而來(lái)的肝癌是高度纖維化的，物理上很難穿透。這些特征使得CAR-T細(xì)胞向腫瘤部位的浸潤(rùn)變得復(fù)雜。CAR-T細(xì)胞治療毒性效應(yīng)包括細(xì)胞因子釋放綜合征、噬血細(xì)胞淋巴組織細(xì)胞增多癥和CAR-T 細(xì)胞相關(guān)性腦病綜合征［21］。在殺傷腫瘤的過(guò)程中，CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，如TNF-α、IFN-α和IL-1等，從而引起急性呼吸窘迫綜合征等的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”［22］。研究表明，黃曲霉毒素B1（AFB1）產(chǎn)生和Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞死亡（碎片）通過(guò)促炎性二十聚糖和細(xì)胞因子風(fēng)暴觸發(fā)肝腫瘤休眠逃逸，AFB1產(chǎn)生的碎片上調(diào)巨噬細(xì)胞環(huán)氧合酶-2（COX-2）、可溶性環(huán)氧化物水解酶（SEH）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá)，這可能是隨后二十烷類(lèi)激素和細(xì)胞因子風(fēng)暴的促成因素［23］。

3.2 CAR-T 細(xì)胞治療的解決策略 Runx3 是一種促進(jìn)T 細(xì)胞在非淋巴部位滯留的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，最近被發(fā)現(xiàn)是CAR-T 細(xì)胞治療的一個(gè)潛在的重要輔助因子［24］。這些研究為免疫細(xì)胞向?qū)嶓w瘤組織的優(yōu)先浸潤(rùn)提供了新的思路。其他一些策略也可以用來(lái)促進(jìn)CAR-T 細(xì)胞向腫瘤組織的浸潤(rùn)。TACE 是肝癌非手術(shù)治療的首選方法［25］，考慮到靜脈注射對(duì)肝癌治療的不良影響，臨床上可能會(huì)以介入性的方式輸注CAR-T 細(xì)胞。該方法可以提高殺傷細(xì)胞向腫瘤組織的浸潤(rùn)效率，大大減少患者的不良反應(yīng)［21］。免疫檢查點(diǎn)分子，如PD-1、T細(xì)胞免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和粘蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白-3，目前被認(rèn)為是肝癌微環(huán)境中的關(guān)鍵因素。針對(duì)這些分子中的一個(gè)或多個(gè)的抗體可以恢復(fù)肝癌中TIL 的功能［26］。而免疫檢查點(diǎn)分子降低了CAR-T 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，CAR-T 和ICIS 的聯(lián)合應(yīng)用可能成為肝癌治療的有效策略。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)破壞CAR-T 細(xì)胞中PD-1 的表達(dá)可能會(huì)增強(qiáng)體內(nèi)和體外的抗腫瘤功能［21］。隨著同種異體細(xì)胞產(chǎn)品的使用，人們要同時(shí)考慮移植物抗宿主?。℅vHD）和宿主抗移植物反應(yīng)，這可能會(huì)限制移植細(xì)胞的植入和增殖［27］。研究表明，COX-2/SEH 雙重抑制途徑能有效抑制二十烷類(lèi)化合物和細(xì)胞因子風(fēng)暴，從而阻止AFB1 碎片誘導(dǎo)的肝癌進(jìn)展［23］。制約CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤成功的障礙之一是難以識(shí)別理想的腫瘤相關(guān)抗原。研究證實(shí)，GPC3 在72% 的肝癌患者中高表達(dá)，AFP 在腫瘤和血清中的高表達(dá)比例高達(dá)75%［28］。提高識(shí)別特異性最常用的方法是制備同時(shí)針對(duì)兩種或兩種以上抗原的CAR-T 細(xì)胞［29］。BURGA 等［3］研究表明門(mén)靜脈輸注CAR-T 細(xì)胞的抗腫瘤效果高于尾靜脈全身輸注。因此，局部注射CAR-T 細(xì)胞不僅可以提高CAR-T 細(xì)胞向腫瘤組織浸潤(rùn)的效率，而且降低了患者不良反應(yīng)的發(fā)生率，故局部注射CAR-T 細(xì)胞可在未來(lái)成為治療原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移癌的一種有潛力的策略。近年來(lái)研究表明，趨化因子與其受體的結(jié)合在介導(dǎo)白細(xì)胞遷移和歸巢、癌癥進(jìn)展和癌變過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用［30］。故可以通過(guò)改造CAR-T 細(xì)胞以表達(dá)合適的趨化因子受體。

4 結(jié)語(yǔ)和展望

近年來(lái)，隨著分子技術(shù)的不斷進(jìn)步，一系列方法被應(yīng)用于原發(fā)性肝癌的免疫治療，并取得了良好的效果。CAR-T細(xì)胞在臨床上治療原發(fā)性肝癌的應(yīng)用越來(lái)越多，CAR-T技術(shù)的優(yōu)勢(shì)也逐漸顯露出來(lái)，并且在臨床研究上取得了較好的療效。由于CAR-T 良好的抗腫瘤作用、腫瘤的異質(zhì)性以及現(xiàn)有治療方法的昂貴，研究個(gè)性化的CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品是CAR-T細(xì)胞治療的方向。細(xì)胞劑量、輸液方式和合適的治療方案是進(jìn)一步需要探討的問(wèn)題。另外，建立以免疫學(xué)家為主導(dǎo)、輔以臨床醫(yī)生的多中心腫瘤免疫治療團(tuán)隊(duì)，將極大推動(dòng)CAR-T 技術(shù)的創(chuàng)新，并極有可能提高未來(lái)原發(fā)性肝癌免疫治療的臨床療效。