南寶 王悅 朱琳 劉翠 張睿

[摘要] 目的 探討腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)調節(jié)素1β（NRG1β）對Cdk5信號通路中P35/P25表達和細胞凋亡的影響。

方法 成年健康雄性Wistar大鼠50只，假手術組（Sham組）10只，其余用線栓法建立大腦中動脈缺血再灌注損傷模型，將造模成功30只大鼠隨機分為模型組（MCAO組）、治療組（NRG組）和抑制劑組（Ros組），每組10只。NRG組和Ros組大鼠經(jīng)頸內(nèi)動脈分別注射NRG1β和Roscovitine各5 μL進行干預治療，Sham組和MCAO組大鼠注射0.1 mol/L PBS 5 μL。用改良神經(jīng)功能缺損評分（mNSS評分）測試大鼠神經(jīng)功能，甲苯胺藍染色觀察神經(jīng)細胞形態(tài)結構，TUNEL法檢測細胞凋亡，免疫組化和Western blot方法檢測神經(jīng)細胞內(nèi)P35/P25的表達。

結果 與Sham組比較，MCAO組mNSS評分顯著升高，凋亡神經(jīng)細胞數(shù)量增多，P35/P25表達顯著增強;NRG組和Ros組大鼠神經(jīng)細胞形態(tài)結構較MCAO組顯著改善，mNSS評分下降，細胞凋亡減少;NRG組大鼠P35/P25表達較MCAO組顯著下降，差異均有顯著性（F=74.34～151.31，P<0.01）。NRG組與Ros組各指標比較差異均無顯著性（P>0.05）。

結論 腦缺血再灌注損傷發(fā)生后，NRG1β可以抑制Cdk5信號通路中P35/P25的表達，減少神經(jīng)細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

[關鍵詞] 神經(jīng)調節(jié)素;腦缺血;再灌注損傷;P35/P25;細胞凋亡;大鼠，Wistar

[中圖分類號] R743.3

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）06-0892-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.180

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211101.1333.002.html;2021-11-02 11：26：02

EFFECT OF NEUREGULIN1Β ON THE EXPRESSION OF P35/P25 AND APOPTOSIS AFTER CEREBRAL ISCHEMIA/REPERFUSION INJURY IN RATS

NAN Bao， WANG Yue， ZHU Lin， LIU Cui， ZHANG Rui

（Institute of Integrative Medicine of Qingdao University Medical College，Qingdao 266021， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of neuregulin1β （NRG1β） on the expression of P35/P25 and apoptosis after cerebral ischemia/reperfusion injury in rats.

Methods A total of 50 healthy male adult Wistar rats were selected， sham-oper-ation group （Sham group） 10 rats， and the suture method was used to establish a model of middle cerebral artery ischemia/reperfusion injury. After successful modeling， 30 rats were randomly divided into model group （middle cerebral artery occlusion （MCAO） group）， treatment group （NRG group）， and inhibitor group （Ros group）， with 10 rats in each group. The rats in the NRG and Ros groups were given injection of NRG1β 5 μL and Roscovitine 5 μL， respectively， via the internal carotid artery， and those in the Sham and MCAO groups were given injection of 0.1 mol/L PBS 5 μL at the same time. Modified Neurological Severity Score （mNSS） was used to evaluate neurological function; toluidine blue staining was used to observe the morphological structure of neural cells; terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling was used to measure cell apoptosis; immunohistochemistry and Western blot were used to measure the expression of P35/P25 in neural cells.

Results Compared with the Sham group， the MCAO group had significant increases in mNSS score， neural cell apoptosis， and expression of P35/P25; compared with the MCAO group， the NRG group and the Ros group had significant improvement in the morphological structure of neural cells and significant reductions in mNSS score and cell apoptosis; compared with the MCAO group， the NRG group had a significant reduction in the expression of P35/P25 （F=74.34-151.31，P<0.01）. There were no significant differences in the above indices between the NRG group and the Ros group （P>0.05）.

Conclusion After cerebral ischemia/reperfusion injury， NRG1β can exert a neuroprotective effect by inhibiting the expression of P35/P25 in the cyclin-dependent kinase 5 signaling pathway and reducing neural cell apoptosis.

[KEY WORDS]neuregulins; brain ischemia; reperfusion injury; P35/P25; apoptosis; rats， Wistar

神經(jīng)調節(jié)素1β（NRG1β）可以通過抑制腦缺血后基質金屬蛋白酶9（MMP9）等炎性因子的表達，下調水通道蛋白4（AQP4）水平而參與神經(jīng)細胞存活以及功能修復[1-3]。大鼠大腦中動脈缺血再灌注（MCAO/R）損傷表現(xiàn)出神經(jīng)功能障礙，預防性應用NRG1β干預可顯著減小腦梗死體積以及神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量[4]，其機制可能與NRG1β的抗炎作用有關，但具體機制有待研究證實。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長分化過程中，細胞周期素依賴性激酶-5（Cdk5）可調節(jié)神經(jīng)細胞的生存、移行和突觸功能等[5-7]。其中，MCAO/R后缺血半影區(qū)的細胞凋亡與Cdk5的過度激活有密切關系，Cdk5抑制劑Roscovitine可阻斷其作用[8]。MCAO/R損傷發(fā)生時，神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子濃度升高而激活鈣蛋白酶，導致Cdk5特定調節(jié)亞單位p35裂解成p25[9]，其活性存在的主要形式為Cdk5/p25，許多細胞凋亡相關底物均可與Cdk5/p25結合而啟動細胞凋亡[10]。張睿等[11-12]研究顯示，大鼠MCAO/R后應用NRG1β可顯著改善其神經(jīng)行為功能，但其作用機制尚未完全闡明。本研究試圖探討NRG1β對MCAO/R后大鼠的神經(jīng)保護作用及其與Cdk5信號通路的關系，進一步闡明其神經(jīng)保護作用機制?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Wistar大鼠50只，購自山東省實驗動物中心，SPF級，體質量240～260 g。室溫（23±2）℃條件下分籠飼養(yǎng)，12 h/12 h晝夜自然光照，自由飲食。術前禁食12 h，不禁水。

1.2 模型制備及實驗分組

隨機取10只大鼠作為假手術組（Sham組），其余40只應用線栓法制備MCAO/R模型[13]。Sham組大鼠線栓置入頸內(nèi)動脈（ICA）10 mm，不入顱。行改良神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）[14]，評分>10分視為造模成功，不成功的10只大鼠剔除。將造模成功的30只大鼠隨機分為模型組（MCAO組）、治療組（NRG組）和抑制劑組（Ros組），每組10只。

1.3 各組處理方法

MCAO組：缺血2 h后拔除線栓，經(jīng)頸外動脈（ECA）殘端向ICA內(nèi)注射0.1 mol/L PBS 5 μL;NRG組：缺血2 h后拔除線栓，經(jīng)ECA向ICA內(nèi)注射NRG1β（R&D Systems，USA）5 μL（2 μg/kg）;Ros組：缺血2 h后拔除線栓，經(jīng)ECA向ICA注射Roscovitine5 μL;Sham組拔除線栓后同步注射0.1 mol/L PBS 5 μL。所有大鼠均于再灌注22 h取材檢測。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 神經(jīng)行為功能評價 各組大鼠取材前均采用mNSS評分評定神經(jīng)行為功能[14]，評分最低為0分，最高18分;得分越高，神經(jīng)功能損傷越嚴重。

1.4.2 甲苯胺藍染色檢測神經(jīng)細胞形態(tài) 以100 g/L水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠（每組隨機取5只），經(jīng)心臟灌注固定取腦。常規(guī)脫水、透明、包埋，自視交叉后方連續(xù)冠狀位切片（厚度5 μm），貼片;甲苯胺藍染色。每張切片在高倍光鏡（400倍）下隨機觀察頂-額葉皮質缺血半影區(qū)4個不重疊的視野，根據(jù)細胞的輪廓、膜完整性、染色深度、胞核固縮、尼氏體等指標判斷細胞損傷變性程度，計數(shù)損傷的變性細胞數(shù)，計算變性細胞指數(shù)（DCI， DCI =變性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%）。

1.4.3 TUNEL方法檢測細胞凋亡 石蠟切片脫蠟入水，按TUNEL試劑盒（Roche公司，美國）說明操作，HRP-抗體孵育，DAB顯色，蘇木精復染。光鏡下呈棕黃色者視為凋亡細胞。陰性對照切片以PBS替代TdT探針染色，不著色。在頂-額葉皮質缺血半影區(qū)隨機選4個視野，高倍光鏡（400倍）下計數(shù)凋亡細胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)（ACI， ACI=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%）。

1.4.4 免疫組化方法檢測P35/P25陽性細胞 石蠟切片脫蠟、水化;熱修復抗原，以體積分數(shù)0.03的H 2O 2孵育，PBS沖洗;然后滴加p35/p25兔單抗（C64B10，CST Co. Ltd. USA，1∶300），37 ℃孵育1 h，PBS沖洗;滴加山羊抗兔IgG/HRP二抗（PV-6001，北京中杉金橋公司），37 ℃孵育，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，胞漿或（和）胞核呈棕黃色者為陽性細胞。陰性對照切片不加一抗，以PBS替代染色，不出現(xiàn)陽性著色。在頂-額葉皮質缺血半影區(qū)隨機選4個高倍（400倍）視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞指數(shù)（PCI，PCI=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%）。

1.4.5 Western blot檢測P35/P25表達 取大鼠頂-額葉皮質缺血半影區(qū)腦組織100 mg，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。按SDS-PAGE試劑盒（碧云天生物研究所）方法制備100 g/L分離膠和50 g/L積層膠，加樣、電泳、轉膜、封閉，然后加兔抗鼠一抗p35/p25（稀釋度為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜。加入山羊抗兔二抗IgG室溫孵育1 h，TBST洗膜顯影，用Bio-Rad 2000型成像系統(tǒng)掃描，Image J軟件分析p35/p25及內(nèi)參照β-actin灰度。計算目的蛋白相對含量（目的蛋白灰度/內(nèi)參灰度值×100%）。

1.5 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s形式表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni（B）法。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 各組大鼠mNSS評分比較

與Sham組相比較，MCAO組、NRG組、Ros組mNSS評分顯著升高，NRG組、Ros組mNSS評分較MCAO組均顯著下降，差異有顯著意義（F=151.31，P<0.05）;NRG組mNSS評分較Ros組略有下降，但差異無顯著性（P>0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠神經(jīng)細胞損傷程度比較

MCAO組的神經(jīng)細胞DCI較Sham組升高，NRG組和Ros組DCI較MCAO組顯著降低，差異有顯著性（F=128.21，P<0.05）;NRG組與Ros組DCI比較差異無顯著性（P>0.05）。見圖1和表1。

2.3 各組神經(jīng)細胞凋亡比較

MCAO組ACI較Sham組顯著升高，NRG組和Ros組ACI較MCAO組明顯下降，差異均有顯著性（F=136.79，P<0.01）;NRG組與Ros組ACI比較差異無顯著性（P>0.05）。見圖2和表1。

2.4 各組大鼠P35/P25陽性細胞數(shù)比較

MCAO組P35/P25 PCI較Sham組明顯升高，NRG組較MCAO組明顯減少，差異有顯著性（F=105.00，P<0.01）;MCAO組與Ros組PCI比較差異無顯著性（P>0.05）。見圖3和表1。

2.5 各組P35/P25表達比較

Western blot結果顯示，MCAO組P35/P25表達較Sham組明顯增強，NRG組較MCAO組明顯降低，差異有顯著性（F=74.34，P<0.01）;MCAO組與Ros組P35/P25表達比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖4和表1。

3 討論

腦缺血再灌注引起的神經(jīng)損傷主要包括興奮性氨基酸釋放、氧化應激、炎癥反應、膠質反應、細胞內(nèi)鈣超載和神經(jīng)細胞凋亡等病理機制。腦缺血中心區(qū)的神經(jīng)細胞死亡以壞死為主，半影區(qū)則以凋亡為主。因此，抑制凋亡可以挽救處于早期凋亡狀態(tài)的神經(jīng)元，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[15]。神經(jīng)調節(jié)素（NRGs）對腦缺血損傷誘導的神經(jīng)細胞凋亡和膠質反應具有顯著的抑制作用[4]。XU等[16]的研究顯示，在永久性MCAO大鼠模型，腦缺血半影區(qū)的NRG1β表達顯著增強。NRG1β激活其功能性受體酪氨酸激酶受體ErbB3或ErbB4，繼而激活酪氨酸激酶，催化多肽鏈中的酪氨酸磷酸化，進而激活下游信號分子，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

在神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默?。ˋD）和帕金森?。≒D）的病理生理過程中，Cdk5分子的活性失調[17-18]，繼而引起其底物蛋白過度磷酸化，最終導致神經(jīng)細胞凋亡和死亡[19]。RASHIDIAN等[20]對腦缺血模型研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后神經(jīng)細胞內(nèi)Cdk5過度激活，Cdk5通路過度激活可以解聚細胞骨架，從而導致神經(jīng)細胞死亡。LOVE[21]的研究發(fā)現(xiàn)，p25較p35更能促進腦卒中后Cdk5的過度激活。因此，TAN等[22]提出，通過阻斷Cdk5信號通路可能減少神經(jīng)細胞死亡，從而為保護腦卒中損傷提供可行的治療策略。本文研究結果顯示，大鼠腦缺血2 h再灌注22 h后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)行為功能障礙，缺血半影區(qū)神經(jīng)細胞凋亡顯著增加，神經(jīng)細胞P35/P25表達顯著增強;應用NRG1β干預治療后，神經(jīng)細胞P35/P25表達以及細胞凋亡率均有下降，神經(jīng)細胞形態(tài)結構顯著改善，mNSS評分顯著下降，這與應用Cdk5特異性抑制劑Roscovitine的結果相似。表明NRG1β的作用機制可能是：通過降低P35/P25表達，進而抑制Cdk5的異?；罨瑥亩l(fā)揮其抗凋亡、神經(jīng)保護作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，NRG-1在少突膠質細胞分化過程中具有重要作用，Nrg1-ErbB信號可能促進小膠質細胞活化，從而導致環(huán)磷酰胺誘導的膀胱炎的機械性超敏化，調節(jié)Nrg1-ErbB信號可能對治療膀胱疼痛綜合征/間質性膀胱炎（BPS/IC）疼痛癥狀具有治療價值，而且這一作用機制與神經(jīng)纖維髓鞘修復有密切關系[23]。DING等[24]研究認為，NRG-1可以通過PI3K-AKT-mTOR信號通路促使星形膠質細胞反向分化為少突膠質細胞，從而修復脊髓內(nèi)神經(jīng)纖維髓鞘的損傷。由此推測，NRG-1的釋放呈遞對中樞神經(jīng)髓鞘再生過程有重要作用，與Cdk5調節(jié)神經(jīng)細胞的生存、移行和突觸功能有一定關系，但其詳細機制有待進一步研究。

綜上所述，NRG1β通過降低P35/P25的表達而抑制Cdk5信號通路的異?；罨?，從而發(fā)揮一定的抗凋亡以及神經(jīng)保護作用。

[參考文獻]

[1]LI Q， ZHANG R， GE Y L， et al. Effects of neuregulin on ex-pression of MMP-9 and NSE in brain of ischemia/reperfusionrat[J]. Journal of Molecular Neuroscience： MN， 2009，38（2）：207-215.

[2]CHEN Y， ZHANG M Z， LI Q， et al. Interfering effect and mechanism of neuregulin on experimental dementia model in rats[J]. Behavioural Brain Research， 2011，222（2）：321-325.

[3]ZHANG R， LIU C， JI Y Q， et al. Neuregulin-1β plays a neuroprotective role by inhibiting the Cdk5 signaling pathway after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats[J]. Journal of Molecular Neuroscience， 2018，66（2）：261-272.

[4]LI Y G， XU Z F， FORD G D， et al. Neuroprotection by neuregulin-1 in a rat model of permanent focal cerebral ischemia[J]. Brain Research， 2007，1184：277-283.

[5]ZHANG J， CICERO S A， WANG L， et al. Nuclear localization of Cdk5 is a key determinant in the postmitotic state of neurons[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2008，105（25）：8772-8777.

[6]JESSBERGER S， GAGE F H， EISCH A J， et al. Making a neuron： Cdk5 in embryonic and adult neurogenesis[J]. Trends in Neurosciences， 2009，32（11）：575-582.

[7]LAI K O， IP N Y. Recent advances in understanding the roles of Cdk5 in synaptic plasticity[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA）-Molecular Basis of Disease， 2009，1792（8）：741-745.

[8]CZAPSKI G A， GASSOWSKA M， SONGIN M， et al. Alterations of cyclin dependent kinase 5 expression and phosphorylation in amyloid precursor protein （APP）-transfected PC12 cells[J]. FEBS Letters， 2011，585（8）：1243-1248.

[9]KALATHUR R K， HERN NDEZ-PRIETO M A， FUTSCHIK M E. Huntington’s disease and its therapeutic target genes： a global functional profile based on the HD Research Crossroads database[J]. BMC Neurology， 2012，12：47.

[10]TIMSIT S， MENN B. Cyclin-dependent kinase inhibition with roscovitine： neuroprotection in acute ischemic stroke[J]. Clinical Pharmacology and Therapeutics， 2012，91（2）：327-332.

[11]張睿. Cdk5通路在腦缺血再灌注損傷中的作用及神經(jīng)調節(jié)素1β抗凋亡機制研究[D]. 青島：青島大學， 2017.

[12]張睿，劉翠，季亞清，等. 神經(jīng)調節(jié)素1β對腦缺血再灌注損傷后Cdk5/p25表達的影響[C]. 第十四次中國中西醫(yī)結合實驗醫(yī)學學術研討會論文匯編， 2017-10-28.

[13]LONGA E Z， WEINSTEIN P R， CARLSON S， et al. Rever-

sible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke， 1989，20（1）：84-91.

[14]CHEN J， SANBERG P R， LI Y， et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats[J]. Stroke， 2001，32（11）：2682-2688.

[15]魏秀娥，榮良群，張清秀，等. Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾對腦缺血再灌注損傷大鼠海馬谷氨酸6受體表達及神經(jīng)細胞凋亡的影響[J]. 中華行為醫(yī)學與腦科學雜志， 2013，22（9）：776-779.

[16]XU Z F， FORD B D. Upregulation of erbB receptors in rat brain after middle cerebral arterial occlusion[J]. Neuroscience Letters， 2005，375（3）：181-186.

[17]QU D B， RASHIDIAN J， MOUNT M P， et al. Role of Cdk5-mediated phosphorylation of Prx2 in MPTP toxicity and Parkinson’s disease[J]. Neuron， 2007，55（1）：37-52.

[18]HASHIGUCHI M， SAITO T， HISANAGA S， et al. Truncation of CDK5 activator p35 induces intensive phosphorylation of Ser202/Thr205 of human tau[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2002，277（46）：44525-44530.

[19]BAJAJ N. Cyclin-dependent kinase-5 （CDK5） and amyotrophic lateral sclerosis[J]. Amyotrophic Lateral Sclerosis and Other Motor Neuron Disorders， 2000，1（5）：319-327.

[20]RASHIDIAN J， ROUSSEAUX M W， VENDEROVA K， et al. Essential role of cytoplasmic cdk5 and Prx2 in multiple ischemic injury models， in vivo[J]. Journal of Neuroscience， 2009，29（40）：12497-12505.

[21]LOVE S. Neuronal expression of cell cycle-related proteins after brain ischaemia in man[J]. Neuroscience Letters， 2003，353（1）：29-32.

[22]TAN X， CHEN Y， LI J， et al. The inhibition of Cdk5 activity after hypoxia/ischemia injury reduces infarct size and promotes functional recovery in neonatal rats[J]. Neurosciences， 2015，290：552-560.

[23]CHEN J L， ZHOU X， DING H L， et al. Neuregulin-1-ErbB signaling promotes microglia activation contributing to mechanical allodynia of cyclophosphamide-induced cystitis[J]. Neurourology and Urodynamics， 2019，38（5）：1250-1260.

[24]DING Z F， DAI C， ZHONG L， et al. Neuregulin-1 converts reactive astrocytes toward oligodendrocyte lineage cells via upregulating the PI3K-AKT-mTOR pathway to repair spinal cord injury[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2021，134：111168.

（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）