劉 方 張 敏 劉恒方 劉田田 郭世燕

1)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052 3)鄭州新鄭國際機場急救中心，河南 鄭州 451161

研究發(fā)現(xiàn)[1-2]B1與B2激肽受體(kinin B1 and B2 receptors；KB1R，KB2R)與癲癇的發(fā)作次數(shù)及發(fā)作持續(xù)時間密切相關(guān)，KB1R激動劑促進肌糖磷酸化一系列病理變化，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高，繼而導(dǎo)致癲癇的發(fā)作[3-5]；此外，KB1R及KB2R可上調(diào)磷脂酶A2表達，使前列腺素增加，從而誘導(dǎo)組織水腫，這些機制與癲癇發(fā)作后的腦組織水腫有關(guān)。已有學(xué)者[6-7]通過放射配基結(jié)合技術(shù)探討KB1R及KB2R不同程度阻斷后對動物模型癲癇發(fā)作的影響[8-10]，揭示KB1R及KB2R在癲癇發(fā)作過程中的作用機制。本研究應(yīng)用丙戊酸鈉干預(yù)癲癇鼠模型，觀察不同時間內(nèi)海馬區(qū)KB1R及KB2R的表達變化，探討其作用機制，試圖尋找癲癇發(fā)作新的作用機制與治療靶點。

1 資料與方法

1．1實驗動物及分組選取鄭州大學(xué)動物中心提供的35只健康雄性Wistar成年大鼠，體質(zhì)量(250±15.45)g，月齡3～4個月，按照隨機化原則分為癲癇實驗?zāi)Ｐ徒M30只，采用氯化鋰-匹羅卡品點燃法制作癲癇模型，再分為癲癇模型干預(yù)組15只，其中癲癇持續(xù)狀態(tài)后急性期組5只(12 h，Ⅰ組)，靜止期組5只(5 d，Ⅱ組)，慢性期組5只(60 d，Ⅲ組)；癲癇模型無干預(yù)組共15只，也分為3個小組，急性期無干預(yù)組5只(12 h，Ⅰa組)，靜止期無干預(yù)組5只(5 d，Ⅱa組)，慢性期無干預(yù)組5只(60 d，Ⅲa組；同時設(shè)置空白對照組5只(Ⅳ組)。

1．2氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型建立及給藥方法Wistar鼠給予氯化鋰125 mg/kg腹腔注射，18～20 h后給予匹羅卡品10 mg/(kg·次)腹腔注射。觀察鼠模型達5級后經(jīng)鼻飼法灌入丙戊酸鈉，每4 h灌胃1次，1 mg/(kg·次)。按照相應(yīng)時間點處死動物，取海馬標(biāo)本置入液氮中保存。

1．3RT-PCR法取約50 mg海馬組織，按相關(guān)文獻法提取總RNA。采用一步反應(yīng)法完成RT-PCR反應(yīng)，其引物及產(chǎn)物片斷見表1。

表1 B1、B2受體及內(nèi)參照β-acting基因引物

1．4Westernblot法檢測KB1R及KB2R蛋白表達采用美國Eagle EyeII型凝膠圖像系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白和標(biāo)準(zhǔn)對照的光密度，取兩者比值作為目標(biāo)蛋白半定量相對值。

2 結(jié)果

2．1氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型的觀察大鼠注射匹羅卡品后，可以觀察到Racine制定的癇性持續(xù)發(fā)作形式。

2．2KB1RmRNA及KB2RmRNA表達變化給予丙戊酸鈉干預(yù)模型后，與Ⅰa組比較，Ⅰ組KB1R mRNA表達均顯著下調(diào)(P<0.05)，Ⅰ組KB2R mRNA表達均顯著上調(diào)(P<0.05)；與Ⅱa組比較，Ⅱ組KB1R mRNA表達顯著下調(diào)(P<0.05)；與Ⅲa組比較，Ⅲ組KB2R mRNA表達均顯著上調(diào)(P<0.05)；與空白對照組比較，Ⅰa組及Ⅱa組KB1R及KB2R表達均顯著上調(diào)(P<0.05)，Ⅲa組KB2R表達均顯著上調(diào)(P<0.05)。見表2。

表2 各組B1、B2 激肽受體的mRNA表達水平比較光密度值OD)

2．3KB1R及KB2R的蛋白質(zhì)表達變化給予丙戊酸鈉干預(yù)模型后，與Ⅰa組比較，Ⅰ組KB1R蛋白質(zhì)表達均顯著下調(diào)(P<0.05)，Ⅰ組KB2R蛋白質(zhì)表達均顯著上調(diào)(P<0.05)；與Ⅱa組比較，Ⅱ組KB1R蛋白質(zhì)表達顯著下調(diào)(P<0.05)；與Ⅲa組比較，Ⅲ組KB2R蛋白質(zhì)表達均顯著上調(diào)(P<0.05)；與空白對照組比較，Ⅰa組及Ⅱa組KB1R及KB2R表達均顯著上調(diào)(P<0.05)，Ⅲa組KB2R表達均顯著上調(diào)(P<0.05)。見表3。

表3 藥物干預(yù)后模型B1、B2 激肽受體蛋白質(zhì)表達水平比較光密度值OD)

3 討論

分子生物學(xué)技術(shù)研究表明[12-13]KB1R激活后可導(dǎo)致肌糖磷酸化，升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平；KB1R及KB2R激活后可誘導(dǎo)組織水腫，產(chǎn)生前列腺素[14]，細(xì)胞分裂素(絲裂原)活化蛋白激酶可通過KB1R及KB2R激活，從而導(dǎo)致早期即刻基因的表達和AP-1易位[15-16]。HOPP等[17]報道的KB1R的激活加劇了興奮性細(xì)胞毒作用和海馬神經(jīng)元的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作誘導(dǎo)了Wistar鼠海馬的KB1R mRNA重新合成，證實同期組的KB1R表達上調(diào)[18-20]。ARGANARAZ等[21-24]用KB1R及KB2R基因敲除小鼠癲癇模型，發(fā)現(xiàn)KB1R基因敲除小鼠自發(fā)癲癇次數(shù)減少，海馬區(qū)細(xì)胞脫失減少，苔蘚纖維增生不明顯；KB1R基因敲除小鼠自發(fā)癲癇次數(shù)增加，海馬區(qū)細(xì)胞脫失明顯增加，苔蘚纖維增生顯著，提示KB1R可能加重顳葉癲癇的病損程度，而KB2R則可能對顳葉癲癇發(fā)作后的海馬組織有保護作用[25-27]。

本實驗中氯化鋰-匹羅卡品點燃鼠癲癇模型的KB1R及KB2R mRNA及蛋白質(zhì)表達水平有較大差異，KB1R在癲癇模型早期表達上調(diào)較明顯，此后逐漸下降，而且KB1R及KB2R mRNA及蛋白質(zhì)表達水平基本一致，與國外研究結(jié)果不完全相符，可能由于本實驗方法較為靈敏的緣故[28-30]。丙戊酸鈉與苯妥英鈉有相同的抑制Na+通道的電生理作用現(xiàn)象，丙戊酸鈉真正的抗癇作用機制尚不十分清楚[31]。丙戊酸鈉干預(yù)癲癇模型鼠后大鼠海馬組織早期KB1R表達明顯減少，晚期KB2R表達明顯增加，支持丙戊酸鈉與顳葉癲癇的KB1R及KB2R表達變化相。丙戊酸鈉可抑制癲癇早期B1激肽受體的高表達，增加晚期B2激肽受體的表達，本研究也證實KB1R及KB2R參與了癲癇的發(fā)生與維持機制，通過丙戊酸鈉干預(yù)進一步表明海馬區(qū)KB1R表達下調(diào)，支持KB1R可能具有細(xì)胞毒作用，KB2R可能有腦細(xì)胞保護作用。因此，通過調(diào)節(jié)海馬區(qū)KB1R及KB2R表達水平亦可能成為抗癲癇新的潛在靶點。