韓芳，李京凌，袁婧，于杰,2*

1(西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院，重慶，400715)2(南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400715)

莼菜(Braseniaschreberi)為莼菜科(Cabombaceae)多年生水生蔬菜，野生種已瀕危[1-2]。原廣泛分布于北半球，現(xiàn)主要分布在亞熱帶等地區(qū)[3]。莼菜具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與保健功能，在我國(guó)逐漸形成重慶石柱、湖北利川、四川雷波和杭州西湖四大產(chǎn)區(qū)[4]。莼菜以被覆透明膠質(zhì)且?guī)矍o的葉為其產(chǎn)品部分，富含多糖、多酚、蛋白質(zhì)等多種活性成分，具有抗菌消炎、抗腫瘤、降血糖等功效，被譽(yù)為“水中人參”“植物胎盤”，為中國(guó)傳統(tǒng)藥食兼用植物[5-7]。

黃酮類化合物是以C6-C3-C6為基本骨架的植物次生代謝產(chǎn)物，依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為黃酮類、花青素類、異黃酮類、黃烷-3-醇類、黃酮醇類、二氫黃酮類等[8]，因其在抗氧化、降低血管脆性、降血脂等方面功效顯著，研究前景廣闊，現(xiàn)已成為藥用、食用等植物研究上不可忽視的研究?jī)?nèi)容[9]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)莼菜的研究主要集中在栽培管理[10-12]、食用等方面[5-6,13]，對(duì)莼菜黃酮類物質(zhì)的研究甚少，國(guó)外研究者對(duì)莼菜研究發(fā)現(xiàn)其含有抗氧化性很強(qiáng)的槲皮素等黃酮類物質(zhì)[14-16]，但目前尚未有關(guān)于莼菜黃酮類物質(zhì)組成及活性研究方面較為系統(tǒng)的文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)我國(guó)莼菜黃酮類物質(zhì)的基礎(chǔ)研究則更少。

本研究首先對(duì)莼菜體外膠質(zhì)、脫膠莼菜葉和未脫膠莼菜葉3個(gè)處理部分的總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，因當(dāng)前主要的堿液脫膠方法對(duì)莼菜活性物質(zhì)具有一定的破壞作用，本研究選取中國(guó)四大產(chǎn)區(qū)莼菜未脫膠葉為試驗(yàn)材料，甲醇為提取劑，系統(tǒng)研究各產(chǎn)區(qū)莼菜總黃酮、黃酮類物質(zhì)的組成及含量、體外抗氧化活性及抑菌活性，最后利用相關(guān)性分析探究黃酮類物質(zhì)組成及含量在抗氧化、抑菌過(guò)程中的作用，旨在為莼菜黃酮類物質(zhì)的進(jìn)一步研究及開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料為采自湖北利川(LC)、四川雷波(LB)、重慶石柱(SZ)和浙江西湖(XH)四大產(chǎn)區(qū)的莼菜(2018年7月末)。選取大小適中、被覆透明膠質(zhì)、無(wú)病害帶嫩莖的莼菜葉，清水沖洗3遍后，手工分離體外膠質(zhì)與莼菜葉，各部分經(jīng)冷凍干燥后粉碎過(guò)40目篩，粉末保存至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

Trolox(純度97%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)(純度99%)、2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪(2,4,6-Tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazine，TPTZ)(純度99%)、2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2’-azinobis-(3-etylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS)(純度99%)；12種黃酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品：蘆丁(純度98%)、牡荊素(純度99%)、紅草苷(純度98%)、二氫楊梅素(純度98%)、楊梅素(99%)、圣草酚(純度98%)、槲皮素(純度98%)、木犀草素(純度98%)、山奈酚(純度98%)、芹菜素(純度98%)、香橙素(純度98%)、異鼠李素(純度98%)，美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；800Y型多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；WT2003CH型電子天平，常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司；UV1700型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海重逢科學(xué)儀器有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀(配有2998PDA 二極管陣列檢測(cè)器)，日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 莼菜提取物制備

稱取各產(chǎn)區(qū)莼菜粉末1.0 g，置于100 mL三角瓶?jī)?nèi)，體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇為提取劑，參考許瑞波等[17]對(duì)同為水生植物睡蓮葉黃酮的提取方法，濾液經(jīng)真空減壓濃縮至膏狀，用體積分?jǐn)?shù)50%的二甲基亞砜溶液溶解并定容至25 mL進(jìn)行測(cè)定，剩余部分保存于-20 ℃下。

1.3.2 總黃酮含量測(cè)定

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，參照GOMEZ等[18]的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。取莼菜提取液0.1 mL，加入純水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2分別為2和0.1 mL，混勻靜置6 min后，加入0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%的AlCl3溶液反應(yīng)5 min，再加入純水0.6 mL于波長(zhǎng)420 nm處測(cè)其吸光度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量。

1.3.3 莼菜黃酮類物質(zhì)的HPLC測(cè)定

參照左龍亞[19]的方法略加修改。色譜條件：色譜柱Inertsil ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，波長(zhǎng)320 nm下檢測(cè)圣草酚、木犀草素、山奈酚、芹菜素、槲皮素5種黃酮類物質(zhì)的含量，350 nm下檢測(cè)紅草苷含量，360 nm下檢測(cè)異鼠李素含量；體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水溶液為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B。

1.3.4 抗氧化活性測(cè)定

DPPH自由基清除率測(cè)定參照GORINSTEIN等[20]的方法略加修改。取莼菜提取液50 μL，加入3.0 mL DPPH反應(yīng)液避光反應(yīng)30 min，于波長(zhǎng) 510 nm處測(cè)其吸光度值，DPPH自由基清除率按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中：A0,空白對(duì)照吸光度值；A1,樣品溶液吸光度。

ABTS自由基清除率的測(cè)定參照ALMEIDA等[21]的方法略加修改。取莼菜提取液25 μL，加入ABTS反應(yīng)液5.0 mL，混勻室溫反應(yīng)10 min,于波長(zhǎng)400 nm處測(cè)吸光度值，ABTS自由基清除率按公式(2)計(jì)算:

(2)

式中：A0，空白對(duì)照吸光度值；A1，樣品溶液吸光度。

鐵還原/抗氧化能力(ferric reducing/ antioxidant power，F(xiàn)RAP)值的測(cè)定參照BENZIE等[22]的方法，取莼菜提取液50 μL，加入FRAP反應(yīng)液5.0 mL混勻，室溫反應(yīng)10 min，于波長(zhǎng)593 nm處測(cè)吸光度值，以Trolox做標(biāo)曲線計(jì)算FRAP值。

抗氧化能力指數(shù)(APC)按公式(3)計(jì)算：

抗氧化能力指數(shù)APC/%=(測(cè)定值/最大值)×100

(3)

1.3.5 抑菌活性測(cè)定

參照呂爽等[23]的濾紙片法測(cè)定莼菜黃酮對(duì)變形桿菌(Proteusvulgaris)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的抑菌活性。在無(wú)菌操作臺(tái)取0.1 mL菌懸液于已倒好的平板上，涂布均勻，將6 mm濾紙片貼在固體培養(yǎng)基上，取10 μL莼菜提取液于濾紙片上，將其置于37 ℃下培養(yǎng)24 h，測(cè)抑菌圈直徑，體積分?jǐn)?shù)50%的二甲基亞砜為陰性對(duì)照。抑菌能力指數(shù)計(jì)算方法同抗氧化能力指數(shù)。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)均為3次生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，Excel 2016及Origin 9.0作圖。采用SPSS 20.0進(jìn)行單因素差異顯著性分析和皮爾森相關(guān)性分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異是極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 莼菜不同處理及各產(chǎn)區(qū)總黃酮含量比較

2.1.1 莼菜不同處理總黃酮含量比較

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.857 7x-0.033 1，(R2=0.999 6)，在0～2 mg/mL的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)莼菜總黃酮含量進(jìn)行定量分析。

由圖1可知，莼菜3個(gè)處理總黃酮含量差異顯著(P<0.05)，其大小順序?yàn)椋好撃z莼菜[(47.975±3.481) mg/g]>未脫膠莼菜[(42.213±1.383) mg/g]>體外膠質(zhì)[(6.189±0.603) mg/g]，體外膠質(zhì)總黃酮含量與孫雨欣等[24]對(duì)莼菜體外膠質(zhì)總黃酮(5.1 mg/g)的測(cè)定結(jié)果相差甚小，其差異可能主要由脫膠方式不同所致。同時(shí)本試驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明莼菜所含黃酮類物質(zhì)不像多糖一樣主要存在于體外膠質(zhì)[4]，而是主要存在于莼菜葉中。

圖1 莼菜不同處理總黃酮含量Fig.1 Total flavonoids content in different treatment parts of water shield 注：組間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 不同產(chǎn)區(qū)莼菜總黃酮含量比較

由圖2可知，四大產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物中總黃酮含量差異顯著(P<0.05)，其含量為(15.845±0.119)～(42.505±0.458) mg/g，其中，石柱莼菜總黃酮含量最高，利川[(39.325±0.681) mg/g]和雷波[(24.243±0.700) mg/g]次之，西湖最低。

圖2 不同產(chǎn)區(qū)莼菜總黃酮含量Fig.2 Total flavonoids content of water shield in different production areas

2.2 不同產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物黃酮類物質(zhì)組成

黃酮類物質(zhì)泛指擁有15個(gè)碳原子的酚類化合物，主要存在于植物的葉、果皮和果實(shí)等部位[25]，其種類和含量因植物種類、生長(zhǎng)環(huán)境及成熟度等而異。研究表明，莼菜耐儲(chǔ)性較差，其活性物質(zhì)會(huì)隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而散失，且隨存儲(chǔ)條件的不同散失程度也不同[26]。LEGAULT等[14]、LEE等[15]研究，發(fā)現(xiàn)莼菜中含有抗氧化作用較強(qiáng)的槲皮素。SHIMODA等[16]以6月份采自日本的莼菜葉為材料，利用質(zhì)譜檢測(cè)確定酚類物質(zhì)種類及結(jié)構(gòu)，共鑒定出5種黃酮類化合物(槲皮素、山奈酚、棉花素、hypolaetin 7-O-glucoside、junsainoside A)和多種酚酸類物質(zhì)。本試驗(yàn)利用12種黃酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(圖3)，通過(guò)高效液相色譜法從莼菜甲醇提取物中共檢測(cè)到7種黃酮類物質(zhì)(圖4、圖5)，木犀草素、異鼠李素、紅草苷、槲皮素、芹菜素、山奈酚和圣草酚，且黃酮類物質(zhì)種類及含量在不同產(chǎn)區(qū)莼菜提取物中存在顯著差異(P<0.05)。本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果存在較大差異，可能主要與所選材料生長(zhǎng)環(huán)境及莼菜成熟度不同有關(guān)，也有可能與所采用的檢測(cè)方法等不同有關(guān)。

1-二氫楊梅素；2-香橙素；3-楊梅素；4-圣草酚；5-槲皮素；6-木犀草素； 7-山奈酚；8-芹菜素；9-紅草苷；10-牡荊素；11-蘆丁；12-異鼠李素 a-320 nm 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；b-350 nm標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖； c-360 nm標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖圖3 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.3 Chromatogram of the standard

試驗(yàn)測(cè)得黃酮類物質(zhì)主要由異鼠李素、槲皮素和山奈酚組成, 含量分別為(37.630±0.797)～(367.534±3.822) mg/kg、(8.931±0.029)～(240.596±1.263) mg/kg和(4.089±0.021)～(48.291±0.687) mg/kg。同為水生植物的荷葉黃酮主要為異鼠李素、槲皮素[27]，王蓮葉主要黃酮類物質(zhì)為槲皮素、山奈酚[28]，與本研究結(jié)果類似。木犀草素的含量為(0.840±0.077)～(4.670±0.045) mg/kg，在西湖莼菜提取物中含量最低，石柱莼菜含量最高。紅草苷僅少量存在于利川、雷波和石柱莼菜提取物中，西湖莼菜提取物未檢測(cè)到該物質(zhì)。圣草酚僅少量存在于雷波和石柱莼菜提取物中，含量分別為(7.543±0.225)和(17.311±0.589) mg/kg?？傮w來(lái)看，石柱莼菜在黃酮類物質(zhì)組成及含量上均高于其他3個(gè)產(chǎn)區(qū)，西湖莼菜黃酮組成及含量在4個(gè)產(chǎn)區(qū)中最低。

a-320 nm部分樣品色譜圖；b-350 nm部分樣品色譜圖； c-360 nm部分樣品色譜圖 1-圣草酚；2-槲皮素；3-木犀草素；4-山奈酚； 5-芹菜素；6-紅草苷；7-異鼠李素圖4 部分黃酮類物質(zhì)色譜圖Fig.4 Chromatogram of flavonoids

圖5 各產(chǎn)區(qū)莼菜黃酮物質(zhì)種類及含量Fig.5 Types and contents of flavonoids in water shield from different producing areas

2.3 抗氧化結(jié)果

2.3.1 不同產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物抗氧化活性比較

由圖6可知，各產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物對(duì)兩類自由基清除率及還原值均具有顯著性差異(P<0.05)。DPPH自由基清除率為(21.188±0.953)%～(88.409±0.810)%，除西湖莼菜外，清除率均顯著高于抗壞血酸陽(yáng)性對(duì)照組(55.227±0.821)%。ABTS自由基清除率為(25.461±1.123)%～(96.245±1.141)%，除西湖莼菜外，其他產(chǎn)區(qū)莼菜提取物ABTS自由基清除率也顯著高于抗壞血酸陽(yáng)性對(duì)照組(51.794±0.575)%。FRAP還原值為(26.455±2.554)～(151.968±1.885)μmol/g，除西湖莼菜外，其他各產(chǎn)區(qū)FRAP還原值與自由基清除率類似，均顯著高于抗壞血酸陽(yáng)性對(duì)照組(53.795±0.419)μmol/g。

整體來(lái)看，ABTS自由基清除率高于DPPH自由基清除率，但3種抗氧化法對(duì)不同產(chǎn)區(qū)莼菜總黃酮抗氧化能力的評(píng)價(jià)大小變化順序一致，均為：石柱莼菜﹥利川莼菜﹥雷波莼菜﹥西湖莼菜。

a-自由基清除率;b-鐵離子還原值圖6 不同產(chǎn)區(qū)莼菜抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of water shield from different producing areas

2.3.2 四大產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物抗氧化活性綜合評(píng)價(jià)

由抗氧化結(jié)果所得的APC指數(shù)均值(%)及排序(表1)表明，各產(chǎn)區(qū)莼菜均具有抗氧化活性，但各產(chǎn)地莼菜抗氧化指數(shù)均值變化幅度較大，在21.73%～100%。其中，石柱莼菜甲醇提取物的抗氧化指數(shù)均值最大，為100%，利川(83.57%)和雷波(78.46%)次之，西湖莼菜最小，為21.73%，與各產(chǎn)區(qū)莼菜總黃酮含量大小順序一致。

表1 各產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物抗氧化活性APC指數(shù)及排序Table 1 APC index and ranking of antioxidant activities of methanol extracts from water shield indifferent producing areas

2.4 抑菌結(jié)果

2.4.1 不同產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物抑菌活性比較

本研究發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)區(qū)莼菜提取物對(duì)3種人體致病菌均具有顯著抑制作用(圖7、表2)，抑菌圈直徑在(8.527±0.564)～(15.660±0.803) mm，這一結(jié)果與袁麗萍等[29]對(duì)荷葉黃酮的抑菌報(bào)道類似。但莼菜黃酮對(duì)3種細(xì)菌的抑制程度不同，總體來(lái)看對(duì)變形桿菌和大腸桿菌的抑菌效果要強(qiáng)于銅綠假單胞菌。依據(jù)董蘭芳等[30]的抑菌圈試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)，3種細(xì)菌對(duì)各產(chǎn)區(qū)莼菜提取物均表現(xiàn)為中度敏感。

圖7 各產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of methanol extract of water shield from different producing areas on bacterial growth

表2 各產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of methanol extract from water shield in different producing areas

2.4.2 不同產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物綜合抑菌活性比較

由表3可知，各產(chǎn)區(qū)莼菜均具有抑菌活性，且各產(chǎn)地莼菜抑菌活性APC指數(shù)均值變化幅度較小(73.55%～100%)。其中，石柱莼菜甲醇提取物的抑菌活性APC指數(shù)均值最大，為100%，利川(85.92%)和雷波(82.13%)次之，西湖莼菜最小(73.55%)。通過(guò)APC指數(shù)均值排序發(fā)現(xiàn)，各產(chǎn)地莼菜抑菌能力大小順序?yàn)椋菏兝ī兝撞ī兾骱?，與各產(chǎn)地莼菜總黃酮含量及抗氧化順序一致。

表3 各產(chǎn)區(qū)莼菜甲醇提取物抑菌活性APC指數(shù)及排序Table 3 APC index and ranking of antibacterial activity of methanol extract from water shield in different producing areas

2.5 莼菜黃酮類物質(zhì)與抗氧化、抑菌活性的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析表明(表4)，莼菜總黃酮及測(cè)定的7

表4 黃酮類物質(zhì)與抗氧化、抑菌活性的相關(guān)性Table 4 Correlation between flavonoids and antioxidant and bacteriostatic activities

種黃酮類物質(zhì)單體均具有不同程度的抗氧化、抑菌作用，且總黃酮含量與紅草苷及異鼠李素分別存在極顯著和顯著正相關(guān)性，對(duì)應(yīng)系數(shù)分別為0.990和0.976?？寡趸嚓P(guān)性分析顯示，總黃酮物質(zhì)含量與DPPH、ABTS和FRAP三種體外抗氧化評(píng)價(jià)法的結(jié)果相關(guān)系數(shù)為0.814～0.919，表明總黃酮物質(zhì)含量在抗氧化過(guò)程中起重要作用。抑菌相關(guān)性分析顯示，槲皮素、木犀草素和山奈酚對(duì)變形桿菌具有極顯著或顯著抑制作用，相關(guān)系數(shù)為0.989～0.998，總黃酮和異鼠李素對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌具有顯著或極顯著抑制作用，相關(guān)系數(shù)在0.966～0.998之間，表明這5類物質(zhì)在抑菌過(guò)程中有重要貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

莼菜中黃酮類物質(zhì)主要存在于莼菜葉中，且四大產(chǎn)區(qū)莼菜總黃酮含量存在顯著的地區(qū)差異，其大小順序?yàn)椋菏徊拴兝ㄝ徊拴兝撞ㄝ徊拴兾骱徊?。本試?yàn)在莼菜中共測(cè)定了7種黃酮類物質(zhì)，分別為異鼠李素、槲皮素、山奈酚、木犀草素、葒草苷、芹菜素和圣草酚，其中異鼠李素、槲皮素和山奈酚為本試驗(yàn)所測(cè)主要黃酮成分，且含量及組成均存在地區(qū)差異?？寡趸耙志囼?yàn)結(jié)果顯示，莼菜抗氧化能力很強(qiáng)，抑菌能力較弱，3種細(xì)菌對(duì)各產(chǎn)區(qū)莼菜提取物均表現(xiàn)為中度敏感。相關(guān)性分析結(jié)果表明，莼菜總黃酮含量及檢測(cè)到的7種黃酮類物質(zhì)單體均具有抗氧化、抑菌作用。