于敬妮 楊新光 楊尚飛 龔 珂 汪曉瑜

西安市第四醫(yī)院眼科，陜西西安 710004

青光眼是一組以視神經(jīng)萎縮和視野缺損為共同特征的疾病，為全球第一位不可逆致盲眼病[1]。而青光眼性視神經(jīng)損傷是其核心問(wèn)題，也是最終病理結(jié)局，組織學(xué)改變?yōu)橐暰W(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retina ganglion cells，RGCs）凋亡、神經(jīng)軸突、細(xì)胞損傷及軸漿流受阻等[2-3]。研究證明[4]青光眼性視神經(jīng)損傷，篩板擠壓，伴有視覺(jué)通路上外側(cè)膝狀體及初級(jí)視皮質(zhì)的跨突觸神經(jīng)元變性，軸漿流受損，導(dǎo)致微循環(huán)改變、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏，視神經(jīng)進(jìn)一步損傷。有報(bào)道藏紅花可以改善微循環(huán)和清除氧自由基，對(duì)缺血再灌注損傷模型有神經(jīng)保護(hù)作用[5]。本課題組曾觀察到藏紅花提取液對(duì)兔高眼壓造成的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞減少及視功能損傷具有保護(hù)作用，推測(cè)與其改善微循環(huán)、抗氧化等效應(yīng)有關(guān)。為了進(jìn)一步了解藏紅花對(duì)慢性高眼壓視神經(jīng)損傷的作用，本研究經(jīng)上丘熒光金逆行標(biāo)記、視神經(jīng)光鏡及透射電鏡等檢查，觀察了藏紅花提取液對(duì)大鼠慢性高眼壓模型視神經(jīng)及其軸漿流的影響，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

0.5 %鹽酸丙美卡因滴眼液及妥布霉素地塞米松眼膏（16D04BA 15 mL 及OFTL1A 3.5 mg，美國(guó)愛(ài)爾康公司）；藏紅花由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科提供。TonopenⅡ眼壓計(jì)（美國(guó)MedtronicsALON 公司）；光學(xué)顯微鏡（CX23 日本奧林巴斯株式會(huì)社）；透射電子顯微鏡（H-9500 日本日立株式會(huì)社）；熒光金染色劑（美國(guó)羅氏公司）。

1.2 藏紅花提取液的配制

藏紅花150 g，蒸餾水煮沸30 min 過(guò)濾2 次，濃縮，3 倍量950 mL/L 乙醇沉淀24 h，過(guò)濾，減壓蒸餾，稀釋成100 mL 裝瓶，滅菌。用水稀釋成50 g/L[6]。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

32 只SPF 級(jí)健康成年雄性SD 大鼠，9～10 周齡，體重250～300 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（陜）2016-0018，合格證號(hào)22-9601018，并通過(guò)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。排除眼部疾病，在避光、安靜，22～24℃，濕度50%～60%的環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.4 慢性高眼壓模型的建立及藥物干預(yù)

32 只大鼠，以隨機(jī)數(shù)字表法分為高眼壓組、對(duì)照組、低劑量組和高劑量組，每組8 只，16 只眼。參考Shareef 等[7]的方法：大鼠用4%水合氯醛麻醉，0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，角鞏膜緣8∶00～1∶00 位剪開(kāi)球結(jié)膜，暴露4 條表淺鞏膜靜脈，大頭針灼燒顳側(cè)、顳上、顳下靜脈；對(duì)照組僅剪開(kāi)球結(jié)膜。術(shù)后妥布霉素地塞米松眼膏涂眼。TonopenⅡ眼壓計(jì)測(cè)眼壓，術(shù)后眼壓>22 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）為造模成功。于術(shù)前和術(shù)后l d、3 d、l 周、2 周、3 周、4 周測(cè)眼壓，連測(cè)3 次，取平均值。測(cè)后用妥布霉素地塞米松涂眼。術(shù)前30 min 及術(shù)后每日10∶00～11∶00，按低劑量組、高劑量組大鼠腹腔分別注射藏紅花提取液20 mg/kg（0.5 mL）和80 mg/kg（2 mL）；高眼壓組和對(duì)照組注射生理鹽水0.5 mL，1 次/d，連續(xù)28 d。

1.5 標(biāo)本制備及觀測(cè)

造模成功并給藥第25 天，大鼠深度麻醉下，固定在腦立體定位儀上，0.5%碘伏消毒，沿正中線切開(kāi)顱頂皮膚向下分離達(dá)顱骨，按照Paxinos 大鼠腦定位圖譜[8]定位雙側(cè)上丘。鉆開(kāi)顱骨相應(yīng)部位，取3%熒光金，每側(cè)上丘注射兩點(diǎn)（深4.0 mm），每點(diǎn)注射1.5 μL，留針5 min。3 d 后，麻醉致死，12 點(diǎn)處做球結(jié)膜縫線標(biāo)記，取出眼球及視神經(jīng)。

眼球固定于4%多聚甲醛磷酸2 h，角膜緣后0.5 mm剪開(kāi)眼球，去除角膜和晶狀體，分離視網(wǎng)膜并定向平鋪，干燥，封片。熒光照片RGC 計(jì)數(shù)，在熒光顯微鏡下用V 波段熒光激發(fā)，距視盤(pán)中心2 mm 上下左右拍照，照片放大150 倍。以MoticMed 6.0 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析（每張切片隨機(jī)取6 個(gè)視野，每個(gè)視野0.2 mm×0.2 mm，視神經(jīng)兩側(cè)各取4 個(gè)視野），計(jì)數(shù)標(biāo)記細(xì)胞。

視神經(jīng)分為球后1～2 mm 處的A 段和2～3 mm處的B 段。A 段用25 mL/L 戊二醛的磷酸鹽固定1 h，10 mL/L 鋨酸固定，脫水，包埋，切1 μm 厚半薄切片，甲苯胺蘭染色，定位，再切成50 nm 的超薄切片。醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后在電鏡下觀察，計(jì)數(shù)視神經(jīng)軸突，每個(gè)標(biāo)本取10 個(gè)方位，每個(gè)方位3 個(gè)視野，求平均值分析。B 段在40 mL/L 多聚甲醛后固定20 min，200 mL/L 蔗糖浸泡至下沉，Tissu-Tek 包埋，冰凍切片，片厚18 μm，置于-20℃，HE 染色觀察視神經(jīng)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下視神經(jīng)的形態(tài)

對(duì)照組：視神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量豐富，纖維排列整齊（圖1A）；高眼壓組：視神經(jīng)色淡，細(xì)胞數(shù)量很少，纖維排列紊亂（圖1B）；低劑量組：細(xì)胞數(shù)量有所增加，纖維排列較整齊（圖1C）；高劑量組：細(xì)胞數(shù)量、纖維排列接近對(duì)照組（圖1D）。

2.2 視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)

圖1 視神經(jīng)橫斷面HE 染色（20×）

對(duì)照組：視神經(jīng)軸突排列整齊，髓鞘、軸膜完整，軸索里細(xì)胞器豐富（圖2A）。高眼壓組：髓鞘間隙增大，結(jié)締組織過(guò)度增生，軸索里線粒體變性，微絲、微管崩解，軸膜髓鞘分離，沃勒變性（圖中紅箭頭），節(jié)段性脫髓鞘（圖中黑箭頭），軸突萎縮（圖中藍(lán)箭頭）（圖2B）。低劑量組：軸突結(jié)構(gòu)破壞及數(shù)量明顯改善，但軸膜厚度不一，仍有脫離（圖2C）。高劑量組：軸突排列較整齊，髓鞘稍薄，軸膜完整，軸索里微管等細(xì)胞器豐富（圖2D）。

圖2 電鏡下視神經(jīng)軸突（6000×）

圖3 視網(wǎng)膜逆行熒光金染色（150×）

視神經(jīng)軸突計(jì)數(shù)：與對(duì)照組比較，高眼壓組軸突數(shù)量減小，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），與高眼壓組比較，低劑量組和高劑量組軸突數(shù)量增多，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），與低劑量組比較，高劑量組軸突數(shù)量增多，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見(jiàn)表1。

2.3 逆行熒光金標(biāo)記節(jié)細(xì)胞

對(duì)照組：標(biāo)記RGCs 各象限分布均勻，視盤(pán)旁密度高，周圍區(qū)密度降低，血管自視盤(pán)放射狀分布，血管走形區(qū)無(wú)RGCs，細(xì)胞形態(tài)多為圓形，部分見(jiàn)軸突，熒光在細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞外未見(jiàn)熒光金滲漏（圖3A）。高眼壓組：RGCs 各區(qū)域密度低，分布不規(guī)律，細(xì)胞質(zhì)熒光金不均勻，部分熒光金滲漏，未見(jiàn)軸突顯現(xiàn)（圖3B）。低劑量組：RGCs 數(shù)目增多，熒光增強(qiáng)，邊界清晰，個(gè)別細(xì)胞可見(jiàn)突起（圖3C）。高劑量組：RGCs 數(shù)目豐富，熒光顯著增強(qiáng)，無(wú)滲漏，血管呈放射狀，其走行區(qū)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞，部分突起清晰可見(jiàn)（圖3D）。

表1 四組視神經(jīng)軸突計(jì)數(shù)比較（個(gè)，）

表1 四組視神經(jīng)軸突計(jì)數(shù)比較（個(gè)，）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.01；與高眼壓組比較，bP ＜0.01；與低劑量組比較，cP ＜0.01

逆行熒光金標(biāo)記節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)：與對(duì)照組比較，高眼壓組節(jié)細(xì)胞數(shù)量減小，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；與高眼壓組比較，低劑量組和高劑量組節(jié)細(xì)胞數(shù)量增多，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；與低劑量組比較，高劑量組節(jié)細(xì)胞數(shù)量增多，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 四組逆行熒光金標(biāo)記節(jié)細(xì)胞數(shù)量比較（個(gè)/mm2，）

表2 四組逆行熒光金標(biāo)記節(jié)細(xì)胞數(shù)量比較（個(gè)/mm2，）

注：與對(duì)照組比較，aP ＜0.01；與高眼壓組比較，bP ＜0.01；與低劑量組比較，cP ＜0.01

3 討論

隨著高眼壓的持續(xù)，視網(wǎng)膜缺血缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)及機(jī)械壓力的持續(xù)存在，節(jié)細(xì)胞缺血受損，其軸突構(gòu)成的視神經(jīng)也損傷、變性，導(dǎo)致視神經(jīng)軸漿流受阻，聚集在篩板區(qū)，此時(shí)線粒體產(chǎn)生的腺苷三磷酸無(wú)法被軸突膜利用，致使軸突蛋白的生成和移動(dòng)大幅度減少，視網(wǎng)膜代謝受到影響進(jìn)而導(dǎo)致節(jié)細(xì)胞凋亡[9-11]；同時(shí)，持續(xù)高眼壓使篩板中的環(huán)繞視神經(jīng)束向后扭曲、變形，篩板受損，直接壓迫靠近膠原纖維的軸突，使軸漿流受到阻滯，靶組織的營(yíng)養(yǎng)供給中斷[12]，神經(jīng)通路受阻，影響神經(jīng)軸漿流運(yùn)輸，共同導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡[13-14]。解剖上視神經(jīng)由RGCs 的軸突匯聚而成，軟腦膜組織緊貼圍繞在視神經(jīng)周圍，發(fā)出結(jié)締組織與神經(jīng)膠質(zhì)構(gòu)成微小間隔，將視神經(jīng)隔成神經(jīng)纖維束，形成髓鞘，其間富含細(xì)胞器。本研究中光學(xué)顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察可見(jiàn)，高眼壓組軸突數(shù)量及結(jié)構(gòu)破壞明顯。低劑量組軸突數(shù)量、神經(jīng)髓鞘崩解和軸突變性程度均有所改善，而高劑量組神經(jīng)結(jié)構(gòu)損傷顯著改善，更接近于對(duì)照組。

以往研究[3,15]表明高眼壓等因素?fù)p傷視神經(jīng)，神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)脫髓鞘改變后，裸露的軸膜更易打開(kāi)電壓門(mén)控鈣通道，鈣離子內(nèi)流增多致軸突損傷，同時(shí)，脫髓鞘導(dǎo)致軸突內(nèi)蛋白骨架破壞，出現(xiàn)沃勒變性，另外，在缺血性改變外，單純沃勒變性也會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)并啟動(dòng)凋亡信號(hào)通路，造成神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[16]。而現(xiàn)代藥理學(xué)已證實(shí)藏紅花有改善血液循環(huán)、抗氧化、調(diào)控鈣離子通道，影響信號(hào)通路、抗凋亡、保護(hù)神經(jīng)等作用[17-18]，在眼部及視神經(jīng)保護(hù)方面也屢有報(bào)道[19-21]。本研究顯示高眼壓組視神經(jīng)破壞明顯，出現(xiàn)一系列結(jié)構(gòu)及數(shù)量改變，而高劑量組，結(jié)構(gòu)損傷性改變明顯好轉(zhuǎn)，幾乎接近于對(duì)照組，說(shuō)明藏紅花提取液對(duì)視神經(jīng)損傷有改善作用，而高劑量作用顯著。

視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞是視網(wǎng)膜中唯一能與大腦中樞發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞的細(xì)胞[22]，也是青光眼等病變的靶細(xì)胞，RGCs 的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)是目前國(guó)際上公認(rèn)的評(píng)價(jià)視神經(jīng)損傷程度的重要形態(tài)學(xué)指標(biāo)[23-24]；熒光金是一種性質(zhì)穩(wěn)定、靈敏度高的熒光示蹤劑，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記，其標(biāo)記的RGCs 呈金黃色強(qiáng)熒光。熒光金標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)，而細(xì)胞核不著色，能很好地顯示樹(shù)突分支，細(xì)胞外無(wú)熒光染料滲漏，與周圍組織分界清晰，除RGCs 層外，其余各層均無(wú)熒光標(biāo)記，除能很好地標(biāo)記RGCs，還能計(jì)數(shù)RGCs，反映軸漿流情況，也能耐受多種組織學(xué)染色處理，不易粹滅[25]。本研究利用大鼠慢性高眼壓模型，以熒光金做為標(biāo)志物，利用軸漿流運(yùn)輸逆行標(biāo)記RGCs，觀察和評(píng)價(jià)藏紅花對(duì)慢性高眼壓損傷后RGCs 的存活情況，反映其對(duì)視神經(jīng)軸漿流的影響。結(jié)果顯示：對(duì)照組熒光金可通過(guò)神經(jīng)傳導(dǎo)通路，利用軸漿逆行傳導(dǎo)，很好地標(biāo)記RGCs。高眼壓組，標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量稀疏，熒光金被大部分阻斷，軸漿逆行傳導(dǎo)被破壞。低劑量組軸漿逆行傳導(dǎo)改善，而高劑量組細(xì)胞數(shù)量增多，形態(tài)顯著改善，甚至接近對(duì)照組。由此不難看出，藏紅花對(duì)視神經(jīng)軸漿流有顯著改善作用，從而營(yíng)養(yǎng)視神經(jīng)，保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，改善視神經(jīng)組織及超微結(jié)構(gòu)，進(jìn)而保護(hù)視神經(jīng)。當(dāng)然藏紅花對(duì)視神經(jīng)損傷的作用也不僅限于本研究，其更深層次的作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步深入研究證明。