王根柱，王小營，尋志坤，孫 強(qiáng)，邢百倩，李忠東

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指自然流產(chǎn)連續(xù)發(fā)生≥2次，其發(fā)生率在整個孕齡婦女群體中占1%～2%[1]。RSA常見病因有子宮畸形或?qū)m腔粘連，黃體功能不足或甲狀腺功能低下，支原體、衣原體和巨細(xì)胞病毒等感染因素以及自身免疫功能紊亂、營養(yǎng)不良、環(huán)境因素等。然而仍有約50%的患者病因不明，稱為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[2]。5，10 -亞甲基四氫葉酸還原酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因多態(tài)性與URSA的關(guān)聯(lián)已被大量研究所證實(shí)。據(jù)報道，MTHFR基因有多達(dá)20余種位點(diǎn)突變，其中677位點(diǎn)突變（677C→T）最為常見。Frosst等[3]發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變可直接導(dǎo)致MTHFR酶活性降低。該酶活性下降，機(jī)體內(nèi)同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）水平升高，破壞機(jī)體凝血與纖溶之間的平衡，使血液處于高凝狀態(tài)，易導(dǎo)致胎盤栓塞、梗死，進(jìn)而誘發(fā)流產(chǎn)。另外，胎盤組織中MTHFR酶活性降低，會使胎兒核酸代謝障礙，引發(fā)DNA和蛋白質(zhì)甲基化不足，導(dǎo)致胚胎發(fā)育異?；蛲Ｖ拱l(fā)育[4]。

截至目前，中國各地關(guān)于MTHFR C677T基因突變與URSA之間的關(guān)聯(lián)性已有大量研究報道，但結(jié)果并不完全一致[5-6]。雖然關(guān)于MTHFR C677T基因突變與URSA之間的關(guān)聯(lián)性已進(jìn)行了Meta分析，但鮮見只針對中國人群[7-8]。即使在亞組中分析了在中國人群中二者的關(guān)聯(lián)性，但納入文獻(xiàn)較少且沒有行敏感性及偏倚性分析。目前僅Chen等[6]在2016年納入16篇文獻(xiàn)對中國女性人群的MTHFR C677T基因突變與URSA之間關(guān)聯(lián)性進(jìn)行Meta分析研究，結(jié)果表明在中國人群中MTHFR C677T是RSA的遺傳性高風(fēng)險因素。然而，方芳等[5]于2017年發(fā)表的1篇病例對照研究的結(jié)果表明，佳木斯地區(qū)健康人群的MTHFR TT基因頻率高于RSA患者。因此MTHFR C677T基因突變與中國女性人群URSA之間的關(guān)聯(lián)性仍需更全面系統(tǒng)的分析與評價。本研究在基于Chen等[6]納入研究的基礎(chǔ)上又將新檢索到的35篇相關(guān)研究納入，共計(jì)51篇，深入探討中國女性人群中MTHFR C677T基因多態(tài)性與URSA之間的關(guān)聯(lián)性，為確定URSA遺傳學(xué)病因提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索 利用PubMed、中國知網(wǎng)（CNKI）和萬方數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索2020年3月以前國內(nèi)外發(fā)表的關(guān)于MTHFR基因多態(tài)性與流產(chǎn)關(guān)系的病例對照研究文獻(xiàn)。在PubMed中，利用下列關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索：“recurrent abortion”or“recurrent spontaneous abortion”or“recurrent miscarriage”or“recurrent pregnancy loss”or“recurrent fetal loss”and “MTHFR”or“methylenetetrahydrofolate reductase”。在 CNKI和萬方數(shù)據(jù)庫中則鍵入“MTHFR”或“5，10 -亞甲基四氫葉酸還原酶”和“流產(chǎn)”進(jìn)行搜索[6-7]。

1.2 評價標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①病例-對照研究；②入選文獻(xiàn)病例組為明確URSA 定義并排除其他臨床上可查的致流產(chǎn)因素后連續(xù)自然流產(chǎn)≥2次的流產(chǎn)個體[9]；③對照組為健康無不良孕產(chǎn)史的婦女。④入選文獻(xiàn)中需分別列出病例組和對照組中各基因型（即 CC、CT、TT）個體數(shù)量，或者通過給出的各基因型頻率計(jì)算出相應(yīng)人數(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①未明確URSA定義；②病例組未排除臨床可致流產(chǎn)因素；③對照組無成功妊娠史；④夫妻雙方均參與基因型測定且不能區(qū)分者；⑤非中、英文文獻(xiàn)以及不是針對中國人群的文獻(xiàn)；⑥綜述、評論等[6-7]。

1.3 文獻(xiàn)篩選、數(shù)據(jù)提取及質(zhì)量評價 嚴(yán)格按照上述標(biāo)準(zhǔn)由2位評價員分別對從各數(shù)據(jù)庫中檢索出的文獻(xiàn)進(jìn)行篩選。從每篇入選文獻(xiàn)中提取第一作者、出版時間、檢測地點(diǎn)、病例組和對照組患者的年齡、病例組流產(chǎn)次數(shù)、對照組基因型頻率分布是否符合遺傳平衡定律（HWE）等信息。采用Newcastle-Ottawa Scale（NOS）量表對入選文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評價，評價標(biāo)準(zhǔn)滿分為 9分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Stata MP16軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta分析。首先以O(shè)R值及其95%CI來分別計(jì)算遺傳模型（TT+CTvsCC，TTvsCT + CC，CTvsCC，TTvsCC，TvsC）的基因分布，然后再以固定效應(yīng)模型或隨機(jī)效應(yīng)模型對上述OR值進(jìn)行加權(quán)合并計(jì)算出最后的合并OR值和95%CI。在異質(zhì)性檢驗(yàn)中，主要通過I2值對異質(zhì)性的大小進(jìn)行評價，當(dāng)I2值≤50%代表各獨(dú)立研究結(jié)果間無異質(zhì)性，采用固定效應(yīng)模型，否則采用隨機(jī)效應(yīng)模型。利用Begg's及Egger's檢驗(yàn)對本次研究中存在的發(fā)表偏倚進(jìn)行評價。

2 結(jié)果

2.1 檢索結(jié)果 通過不同數(shù)據(jù)庫檢索出943篇文獻(xiàn)（其中，PubMed 795篇，CNKI和萬方148篇）經(jīng)Endnote 17查重后共獲得350篇相關(guān)文獻(xiàn)。根據(jù)文獻(xiàn)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)逐層篩選后，最終納入51篇有關(guān)MTHFR C677T與URSA關(guān)聯(lián)性的病例-對照研究，包括6 824例URSA患者和8 192例健康對照。

2.2 納入研究的基本特征與質(zhì)量評價 納入各項(xiàng)研究的基本特征和質(zhì)量評價結(jié)果等信息見表1。所有納入文獻(xiàn)均按照NOS量表進(jìn)行評價且均為高于5分的高質(zhì)量文獻(xiàn)。

2.3 總體及亞組結(jié)果分析 病例組和對照組基因型及等位基因總體分布頻率分析結(jié)果顯示，病例組MTHFR C677T位點(diǎn)TT基因型分布頻率顯著高于對照組（P＜0.05），CC基因型分布頻率顯著低于對照組（P＜0.05），且2組間C、T基因頻率比較差異用統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨后對納入的51個病例-對照研究進(jìn)行總體Meta分析和亞組Meta分析?？傮wMeta分析結(jié)果表明，MTHFR C677T多態(tài)性與URSA患病風(fēng)險增加具有相關(guān)性。各亞組Meta分析結(jié)果與總體Meta分析結(jié)果一致（表2）。在異質(zhì)性方面，排除不符合HWE的研究后TT+CTvsCC、CTvsCC組的異質(zhì)性（48.4%和24.0%）降至50%以下；中國北方地區(qū)各研究間異質(zhì)性高、南方地區(qū)的異質(zhì)性低且均低于50%。流產(chǎn)次數(shù)≥3次的Meta分析結(jié)果中只有CTvsCC組的異質(zhì)性低于50%。此外，針對中國北方和南方地區(qū)的分析結(jié)果表明，北方和南方地區(qū)在MTHFR C677T多態(tài)性與URSA患病風(fēng)險方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表1 納入研究的基本特征

表2 MTHFR C677T基因多態(tài)性與URSA發(fā)病風(fēng)險分析

2.4 敏感性分析 為確保整體研究結(jié)果不受任何單個研究的異質(zhì)性干擾，通過逐一剔除每項(xiàng)病例對照研究后，對剩余研究重新進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，剔除任何單一研究后MTHFR C677T多態(tài)性與URSA患病風(fēng)險增加仍具有相關(guān)性。此外，敏感性分析發(fā)現(xiàn)，尚鵬超研究結(jié)果對整體研究結(jié)果影響較大，將其剔除后各組的異質(zhì)性均降至50%以下。

圖1 納入文獻(xiàn)發(fā)表性偏倚的漏斗圖

2.5 發(fā)表偏倚分析 首先通過漏斗圖對發(fā)表偏倚進(jìn)行定性分析結(jié)果顯示，雖然散點(diǎn)分布基本對稱，但有6項(xiàng)研究散點(diǎn)在95%可信線外（圖1）。隨后通過Begg's及Egger's檢驗(yàn)對發(fā)表偏倚進(jìn)行量化檢測。Begg's test中P=0.03，提示本研究存在明顯發(fā)表偏倚。Egger's test中bias的P=0.60，且bias的95%可信區(qū)間為（－0.91～－1.56）經(jīng)過零點(diǎn)，提示本研究無明顯發(fā)表偏倚。

3 討論

Meta分析共納入51篇病例對照研究，包含6 824例URSA患者和8 192例有過至少1次成功妊娠史的健康對照。結(jié)果表明，中國女性MTHFR C677T基因多態(tài)性與URSA發(fā)病顯著相關(guān)，其中攜帶TT基因型的女性發(fā)生URSA的風(fēng)險較攜帶CC基因型的女性高207%，是URSA發(fā)病的高危遺傳因素。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，納入的51篇文獻(xiàn)中有36篇結(jié)果顯示攜帶TT基因型的女性發(fā)生URSA的風(fēng)險較高，總體Meta分析結(jié)果與這些研究結(jié)果一致。Wu等[10]和Du等[11]在各自Meta分析中不僅納入了中國女性人群也納入了國外人群，其結(jié)果表明MTHFR C677T基因多態(tài)性是RSA的危險因素。Chen等[6]只納入中國女性人群的Meta分析結(jié)果也顯示攜帶TT基因型的女性RSA發(fā)病風(fēng)險較攜帶CC基因型增加255%，提示MTHFR C677T基因多態(tài)性與RSA發(fā)病顯著相關(guān)。盡管上述Meta分析中納入病例組為RSA人群，與本研究納入的URSA人群略有不同，但Meta分析結(jié)果與本研究相似。這些結(jié)果進(jìn)一步提示，對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者無論有無明確病因MTHFR C677T基因多態(tài)性均是導(dǎo)致復(fù)發(fā)流產(chǎn)的重要危險因素。然而以高加索人或歐洲人群為納入對象的總體Meta分析或亞組Meta分析結(jié)果表明，MTHFR C677T基因多態(tài)性與URSA風(fēng)險之間無顯著相關(guān)性[10]。造成上述結(jié)果不一致的原因可能是，MTHFR C677T基因型在不同國家、種族間存在差異性。

雖然目前的Meta分析研究均表明在中國女性中MTHFR C677T基因型TT突變患者發(fā)生URSA風(fēng)險較高，但需注意各研究間明顯的異質(zhì)性。Chen等[6]Meta分析發(fā)現(xiàn)，若MTHFR各基因型分布頻率符合HWE定律，研究間的異質(zhì)性降低[6]。而本研究排除不符合HWE的研究后，僅TT+CTvsCC、CTvsCC組的異質(zhì)性降至50%以下。而將尚鵬超的研究剔除后，各組間的異質(zhì)性均降至50%以下，其原因可能是該研究納入患者數(shù)量較多，占權(quán)重較大所致[12]。此外，飲食習(xí)慣、基因間的相互作用、父親的基因型等也會對研究的異質(zhì)性產(chǎn)生影響[13]。偏倚對Meta分析結(jié)果的真實(shí)性和可靠性也有影響。本研究經(jīng)Begg's檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)TT+CTvsCC模型組存在明顯的發(fā)表偏倚，其可能的原因是非HWE研究的納入，將其排除后則提示無明顯發(fā)表偏倚（P=0.21）。發(fā)表偏倚已經(jīng)成為一種科學(xué)上的誤導(dǎo)，其存在會對現(xiàn)有的研究進(jìn)行過度的評價。因此，仍需更高質(zhì)量的臨床研究來證實(shí)中國女性人群中MTHFR C667T基因多態(tài)性與URSA發(fā)病的相關(guān)性。

總之，在中國女性人群中MTHFR C677T基因多態(tài)性與URSA發(fā)病存在關(guān)聯(lián)性，其中TT基因突變型是URSA的高危遺傳性因素。在中國女性人群中應(yīng)積極篩查攜帶MTHFR C677T等位基因T個體，尤其攜帶基因型TT的個體進(jìn)而降低URSA的發(fā)生率。然而由于異質(zhì)性、發(fā)表偏倚的存在，本研究仍需更高質(zhì)量的臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。