許正卿 周敏 宋鵬濤 王金志 劉順林*

肺癌是導(dǎo)致癌癥死亡的主要惡性疾病。非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要病理類型，腺癌占比最高［1-2］。由于肺癌的發(fā)病率和病死率較高，早診斷早治療，對(duì)患者預(yù)后起重要作用。作為Copines家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員，CPNE1在骨肉瘤中具有重要的臨床意義［3］，但目前尚未發(fā)現(xiàn)其在肺癌中的作用。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法檢測(cè)CPNE1蛋白在肺腺癌組織與肺正常組織中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析，初步探討CPNE1在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 肺腺癌石蠟組織標(biāo)本收集 收集于浙江省湖州市中心醫(yī)院、浙江省安吉縣人民醫(yī)院2006年至2009年外科切除且經(jīng)病理確診的人肺腺癌石蠟包埋標(biāo)本128例，所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療。樣本中男67例，女61例，年齡22～80歲，平均年齡61歲。正常肺組織30例，男20例，女10例；年齡46～74歲，平均年齡60歲。所有組織標(biāo)本均經(jīng)兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生證實(shí)。所有標(biāo)本均按照2009年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（AJCC，2009）TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期，Ⅰ、Ⅱ期69例，Ⅲ、Ⅳ期59例；按分化程度低分化65例，高、中分化63例。

1.2 試劑與方法 實(shí)驗(yàn)所用組織蠟塊經(jīng)連續(xù)切片成4 μm厚度后進(jìn)行免疫組化染色，免疫組化試劑盒及兔抗人CPNE1多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司（美國(guó)）。采用免疫組化方法檢測(cè)CPNE1蛋白在肺癌組織中的表達(dá)，抗體稀釋液代替作為陰性對(duì)照。

1.3 免疫組化結(jié)果判定 CPNE1蛋白在肺腺癌組織及肺正常組織中免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參考YU等［4］報(bào)道方法。CPNE1蛋白陽(yáng)性表達(dá)為在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。在高倍鏡下（SP×400）觀察下，以5個(gè)不同視野為隨機(jī)采取對(duì)象，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)，按照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比計(jì)算分值：1分為陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比<10%，2分為陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比>10%且≤50%，3分為陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比>50%且≤75%，4分為陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比>75%；同時(shí)，按照染色強(qiáng)弱不同程度計(jì)算分值：1分陰性，2分弱染色，3分中等強(qiáng)度染色，4分強(qiáng)染色。通過(guò)上述兩種不同計(jì)算分值乘積判斷結(jié)果：<4分為（-）；4～8分為（+）；>8～12分為（++）；>12～16分為（+++）。高表達(dá)為（++）和（+++）級(jí)；低表達(dá)為（-）和（+）級(jí)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CPNE1在肺腺癌組織與肺正常組織中表達(dá) CPNE1蛋白表達(dá)主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞膜表達(dá)較少，見圖1。低表達(dá)49例（38.28%），高表達(dá)79例（61.72%），30例肺正常組織均為低表達(dá)。

2.2 CPNE1表達(dá)高低與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 CPNE1蛋白的表達(dá)與肺腺癌組織臨床分期（P<0.05）、TNM分期（P<0.05）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P<0.05）存在相關(guān)性，見表1。

圖1 CPNE1在肺腺癌組織與肺正常組織中表達(dá)

表1 CPNE1表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性［n（%）］

3 討論

據(jù)最新的全球腫瘤發(fā)病統(tǒng)計(jì)資料顯示，肺癌的發(fā)病率和死亡率居各種惡性腫瘤的首位，而且對(duì)其能做出早期診斷和預(yù)后判斷的有效分子標(biāo)志物極少。根據(jù)目前的研究，多種癌基因和抑癌基因突變?cè)诜伟┑陌l(fā)生發(fā)展中起相當(dāng)作用，如癌基因K-RAS、EGFR、PD-L1，抑癌基因突變TP53、RB等［5-6］。近年來(lái)，研究認(rèn)為肺癌是一種具有異質(zhì)性的疾病，不同癌基因、抑癌基因參與不同患者的發(fā)病，即便是同一個(gè)患者肺癌的發(fā)病過(guò)程中，也可能存在不同的癌基因或抑癌基因參與［7-9］。目前所知的癌基因、抑癌基因突變并不能解釋所有的肺癌發(fā)生發(fā)展，這也提示存在不為所知的基因參與到肺癌的發(fā)病中。

CPNE蛋白家族（Copines）是一類磷脂結(jié)合蛋白，家族成員均有共同的結(jié)構(gòu)特征：C末端有1個(gè)A結(jié)構(gòu)域，與整和蛋白胞外區(qū)段的A結(jié)構(gòu)域間具有較高的同源性；N末端有2個(gè)C2結(jié)構(gòu)域，與具有Ca2+依賴和磷脂結(jié)合特性的C2結(jié)構(gòu)域具有高度相似性。整和蛋白的A結(jié)構(gòu)域能與Ca2+和Mg2+結(jié)合，也是整和蛋白與胞外配體發(fā)生蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域。CPNE蛋白與其目標(biāo)蛋白相互作用可能與目標(biāo)蛋白募集或調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白的酶活性有關(guān)［10-11］。

CPNE1作為一種可溶性膜結(jié)合蛋白，可以通過(guò)C末端A結(jié)構(gòu)域與不同細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合。進(jìn)一步研究表明，該A結(jié)構(gòu)域已在多種整合素和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中進(jìn)行研究，并可作為蛋白結(jié)合域［12］。C2結(jié)構(gòu)域?qū)︹}和磷脂結(jié)合非常重要［13-14］。此外，多種蛋白質(zhì)已被鑒定為Copine靶標(biāo)，其中較多是參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的蛋白質(zhì)，包括MEK1/ERK、蛋白磷酸酶5和CDC42調(diào)節(jié)蛋白激酶［15］。最近一項(xiàng)研究表明，在前列腺癌中CPNE 1表達(dá)高于正常前列腺組織，CPNE1過(guò)表達(dá)與前列腺癌患者分期及預(yù)后相關(guān)，且CPNE 1可以作為前列腺癌診斷的一個(gè)指標(biāo)，進(jìn)一步通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)CPNE1與TRAF2顯著相關(guān)［16-17］。而在骨肉瘤中的研究顯示，干擾CPNE 1可以抑制骨肉瘤Saos-2細(xì)胞的增殖和克隆，并對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。干擾骨肉瘤中CPNE 1的表達(dá)使Saos-2細(xì)胞可以改變基因表達(dá)譜。改變的基因參與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括MAPK途徑，TGF-β通道等。此外，高群等［18］研究CPNE 1與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，在體外缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中，干擾CPNE 1基因后發(fā)現(xiàn)，干擾CPNE 1基因表達(dá)后同時(shí)下調(diào)C-caspase3蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡率。通過(guò)敲減心肌細(xì)胞CPNE 1基因的表達(dá)，可以使凋亡相關(guān)Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)、同時(shí)Bax蛋白表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，該研究結(jié)果表明CPNE 1能夠抑制心肌H9c2細(xì)胞凋亡［18-19］。此外 C-caspase 3是Caspase 3的剪切體，也是細(xì)胞凋亡發(fā)生的分子標(biāo)志物，參與多種細(xì)胞凋亡過(guò)程［20］。干擾CPNE 1基因表達(dá)后可能通過(guò)NF-κB活性增強(qiáng)抑制心肌細(xì)胞的凋亡發(fā)生，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用［21-22］。

CPNE 1在非小細(xì)胞肺癌中的作用尚不清楚。本資料結(jié)果顯示，CPNE 1在腺癌中的表達(dá)高于正常肺組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明CPNE1在肺腺癌中可能起到促癌基因的作用。進(jìn)一步分析CPNE 1蛋白表達(dá)與肺癌患者臨床病理各參數(shù)的相關(guān)關(guān)系，分層分析發(fā)現(xiàn)CPNE 1基因表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者性別、年齡、腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05），但在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織中表達(dá)高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示CPNE 1基因表達(dá)水平可能與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后有關(guān)。非小細(xì)胞肺癌中CPNE 1基因具有促癌作用，但其如何介導(dǎo)肺癌的發(fā)生發(fā)展目前尚未得知，需進(jìn)一步研究。