梁運(yùn)特 黃仲海 廖志遠(yuǎn) 張琴 湯勇 孫平良

摘 要 目的：研究安腸湯對(duì)2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）致潰瘍性結(jié)腸炎（UC）模型大鼠Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路及糞鈣衛(wèi)蛋白（FC）表達(dá)的影響。方法：將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組[雙歧桿菌活菌膠囊，5 mL（含雙歧桿菌活菌0.35 g）]和安腸湯低、中、高劑量組（1、5、10 mL，每mL約相當(dāng)于生藥總量0.11 g），每組15只。除空白組大鼠注入生理鹽水外，其余各組大鼠均采用TNBS結(jié)合乙醇復(fù)合灌腸法建立UC模型。造模成功2 d后，空白組、模型組大鼠灌胃生理鹽水5 mL，各藥物組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)給藥14 d。末次給藥后，采用蘇木精-尹紅染色法觀察大鼠結(jié)腸組織的病理改變;采用Western blotting法檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織中TLR4、TNF受體關(guān)聯(lián)因子6（TRAF6）、NF-κB蛋白的表達(dá)水平;采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)TLR4、TRAF6、TNF-α、NF-κB mRNA的表達(dá)水平;采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)大鼠血清TNF-α、IL-6以及糞便樣品中FC的水平。結(jié)果：與空白組比較，模型組大鼠的結(jié)腸黏膜嚴(yán)重受損，其結(jié)腸組織中TLR4、TRAF6、NF-κB蛋白和TLR4、TRAF6、TNF-α、NF-κb mRNA的表達(dá)水平以及血清TNF-α、IL-6及糞便樣品中FC水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，各藥物組大鼠結(jié)腸組織病變均有不同程度的改善，且上述指標(biāo)水平均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：安腸湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路及FC水平來(lái)減輕UC模型大鼠的炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞 潰瘍性結(jié)腸炎;安腸湯;Toll樣受體4;TNF受體關(guān)聯(lián)因子6;核因子κB;糞鈣衛(wèi)蛋白

中圖分類(lèi)號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）02-0189-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.02.11

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of Anchang decoction on TLR4/NF-κB signaling pathway and the expression of fecal calprotectin （FC） in TNBS-induced ulcerative colitis （UC） model rats. METHODS： SD rats were randomly divided into blank group， model group， positive control group [Live Bifidobacterium capsules，5 mL （containing Bifidobacterium 0.35 g）]， Anchang decoction low-dose， medium-dose and high-dose groups （1，5，10 mL， each milliliter is approximately equivalent to 0.11 g of total crude drug）， with 15 rats in each group. Other groups were given TNBS combined with ethanol enema to establish UC model rat， except blank group was given normal saline. Two days after successful modeling， blank group and model group were given normal saline 5 mL， administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 14 d. After last medication， HE staining was used to observe the pathological change of colon tissue in rats. Western blotting assay was used to detect the protein expression of TLR4， TRAF6 and NF-κB in colon tissues of rats; Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect mRNA expression of TLR4， TRAF6， TNF-α and NF-κB; ELISA assay was adopted to detect serum level of TNF-α， IL-6 and FC in stool samples. RESULTS： Compared with blank group， the colonic mucosa of model group was severely damaged， and the protein expression of TLR4， TRAF6 and NF-κB， mRNA expression of TLR4， TRAF6， TNF-α and NF-κb as well as serum levels of TNF-α， IL-6 and FC level in stool samples were increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the pathological changes of colon tissue in rats were improved in different administration groups to different extents， and above indexes were all decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Anchang decoction may relieve the inflammation of UC model rats by regulating the TLR4/NF-κB signaling pathway and the expression of FC.

KEYWORDS? ?Ulcerative colitis; Anchang decoction; TLR4; TRAF6; NF-κB; Fecal calprotectin

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）以反復(fù)腹瀉、排膿血便、身體消瘦、發(fā)熱等炎癥癥狀為主要臨床表現(xiàn)，其病情反復(fù)、難以治愈，逐漸成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[1]。Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路被認(rèn)為是促進(jìn)炎癥因子釋放的重要途徑，當(dāng)該通路被激活時(shí)，促炎因子[如腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素1（IL-1）等]得以表達(dá)，并參與機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過(guò)程[2-3]。李姿慧等[4]研究證實(shí)，參苓白術(shù)散能夠抑制UC模型大鼠NF-κB相關(guān)蛋白的表達(dá)，下調(diào)血清TNF-α、IL-6及IL-1β的表達(dá)水平，從而對(duì)大鼠的結(jié)腸黏膜起到保護(hù)作用，說(shuō)明NF-κB信號(hào)通路與UC的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

安腸湯是廣西中醫(yī)藥大學(xué)肖振球教授治療UC的經(jīng)驗(yàn)方。肖教授認(rèn)為，UC屬中醫(yī)“痢疾”范疇，該病易反復(fù)發(fā)作，遷延日久，致脾腎陽(yáng)虛為主，濕毒瘀邪停滯胃腸為標(biāo)，強(qiáng)調(diào)正虛邪戀為根本，因此創(chuàng)立安腸湯扶正祛邪[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，安腸湯能顯著改善UC模型大鼠的疾病狀態(tài)，減弱其巨噬細(xì)胞吞噬能力，改善大鼠腸道微生態(tài)，降低血清內(nèi)毒素;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，糞鈣衛(wèi)蛋白（FC）在UC模型大鼠急性炎癥期表達(dá)量上升，可用于評(píng)價(jià)腸道的炎癥反應(yīng)情況[6]。那么其作用的機(jī)制是否與TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。為此，本研究以UC模型大鼠為研究對(duì)象，擬通過(guò)探究安腸湯干預(yù)對(duì)模型大鼠結(jié)腸組織中TLR4、TNF受體關(guān)聯(lián)因子6（TRAF6）、TNF-α、NF-κB mRNA以及相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響，闡明該方通過(guò)調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路及FC水平以達(dá)到防治UC的藥效作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

本文所用的儀器有：T18型組織勻漿機(jī)（德國(guó)IKA公司）、TU-100C型恒溫金屬浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、單道移液器和5418R型低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）、一次性使用真空采血管（江西精致科技有限公司）、配套蛋白轉(zhuǎn)印模塊（濕轉(zhuǎn)）及PowerPac Basic型電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、TD4型普通離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、DW-86L728J型醫(yī)用低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司）、FC-1100型超微量核酸檢測(cè)儀（青島愛(ài)普科生物工程有限公司）、G8830-64001型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國(guó)Agilent公司）、50I型生物顯微鏡（日本Nikon公司）、Tanon-5200型凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）、HED-SY96S型酶標(biāo)儀（山東霍爾德電子科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

安腸湯方藥的組成為補(bǔ)骨脂25 g、黃芪20 g、黨參15 g、白頭翁15 g、茯苓15 g、檳榔15 g、熟附子15 g、地榆15 g、赤芍15 g、雞內(nèi)金10 g、薏苡仁10 g、干姜10 g、白術(shù)10 g、木香10 g、延胡索10 g、甘草10 g，用2 000 mL水煎，分2次口服，每日1劑。安腸湯原藥材依據(jù) 2015 年版《中國(guó)藥典》（一部）[7]進(jìn)行炮制，并由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科加工制備（原藥材全部購(gòu)自廣東康美藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部陳超副主任藥師鑒定為真品）。雙歧桿菌活菌膠囊[陽(yáng)性對(duì)照藥，國(guó)藥準(zhǔn)字S10960040，批號(hào)C13201000927，規(guī)格0.35 g（含0.5億活菌）]購(gòu)自麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠。本實(shí)驗(yàn)用藥處方及用量全部經(jīng)過(guò)廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部審核。

水合氯醛溶液（批號(hào)2013101801）、甲醛（批號(hào)20130817）均購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠;Takara反轉(zhuǎn)錄試劑（批號(hào)AI80462A）購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司;Triquick Reagent總RNA提取試劑（批號(hào)20200212）、高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液（批號(hào)69067530）、蛋白酶抑制劑混合液（100×PIC）（批號(hào)P6730）、脫脂奶粉（批號(hào)EZ5619C137）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（TBST，批號(hào)70015639）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)PC0020）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;5%2，4，6-三硝基苯磺酸溶液（TNBS，批號(hào)2508-19-2）購(gòu)自南寧市托普邦生物科技有限公司;Trans Script?-Uni一步gDNA拆卸和cDNA合成超混合液（批號(hào)N20909）購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司;兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（批號(hào)AB-P-R001）購(gòu)自南寧市托普邦生物科技有限公司;大鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號(hào)SLBP0889V）、完全弗式佐劑（批號(hào)20170301）均購(gòu)自上海希格瑪高技術(shù)有限公司;超敏型化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑（批號(hào)BL523A）購(gòu)自合肥蘭杰柯科技有限公司;0.9%氯化鈉注射液（批號(hào)H20033974，規(guī)格500 mL;作生理鹽水用）購(gòu)自貴州科倫藥業(yè)有限公司;小鼠抗大鼠TLR4一抗（批號(hào)J1016）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;兔抗大鼠NF-κB p65一抗（批號(hào)8242S）購(gòu)自美國(guó)CST公司;兔抗小鼠TRAF6 一抗（批號(hào)ab40675）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;大鼠IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）分析試劑盒（批號(hào)JYM0651Ra）、大鼠FC ELISA分析試劑盒（批號(hào)JYM1159Ra）均購(gòu)自武漢基因美生物科技有限公司;大鼠TNF-α ELISA分析試劑盒（批號(hào)E-EL-R2856c）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的兔二抗（批號(hào)7074、7076）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;其余試劑均為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格。

1.3 動(dòng)物

健康SPF級(jí)SD成年大鼠90只，2月齡，雄雌各半，體質(zhì)量（250±20）g，購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)的SCXK（湘）2014-0011。動(dòng)物由廣西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)分子實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行專(zhuān)人飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為安靜、通風(fēng)、清潔、晝夜室溫20～23 ℃、相對(duì)濕度50%～60%。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為2013（KF）-E- 003。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和安腸湯低、中、高劑量組，每組15只。參照文獻(xiàn)方法（TNBS結(jié)合乙醇復(fù)合灌腸法）[8]建立UC大鼠模型：所有大鼠禁食不禁水24 h后，均腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.003 mL/g）進(jìn)行麻醉，順著大鼠肛門(mén)-直腸生理彎曲插入軟管約7 cm，注入TNBS/乙醇（TNBS+等體積50%乙醇，100 mg/kg，以TNBS計(jì)）造模，再將大鼠倒立保持2 min以保證藥液充分吸收。造模成功標(biāo)準(zhǔn)[8]：（1）大鼠反復(fù)大便溏泄甚至帶有膿血;（2）大鼠食欲及體質(zhì)量均下降;（3）大鼠精神萎靡、毛色枯槁、畏寒弓背，群體聚堆;具備兩項(xiàng)及以上者認(rèn)定為造模成功。空白組大鼠除注入生理鹽水外，其余操作同前。大鼠麻醉清醒后，可自由進(jìn)飲進(jìn)食。

造模成功2 d后，空白組和模型組大鼠灌胃生理鹽水5 mL，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠灌胃雙歧桿菌活菌膠囊懸液5 mL（以0.9%氯化鈉注射液為溶劑，含雙歧桿菌活菌0.35 g），安腸湯組大鼠按比例灌胃低、中、高劑量安腸湯溶液1、5、10 mL，每mL約相當(dāng)于生藥總量0.11 g（各藥物組用藥劑量均參照前期試驗(yàn)[1]并按人與動(dòng)物體質(zhì)量系數(shù)換算而得），每日1次，連續(xù)給藥14 d。

2.2 標(biāo)本采集與處理

末次給藥后，所有大鼠均禁食不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉后，立即剖腹取腹主動(dòng)脈血約8 mL，靜置30 min，以3 000 r/min離心15 min分離上層血清，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存，待測(cè)。統(tǒng)一在距大鼠肛門(mén)約7 cm處取結(jié)腸組織后并置于4%多聚甲醛溶液中密封，置于4 ℃下避光保存，待測(cè)。取腸道內(nèi)糞便樣品適量，置于-20 ℃冰箱中保持，待測(cè)。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 大鼠結(jié)腸組織病理情況觀察 取“2.2”項(xiàng)下經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定后的大鼠結(jié)腸組織適量，依次進(jìn)行石蠟包埋、切片（厚度10 μm）、脫蠟、蘇木精染液染色、沖洗、分化液分化、伊紅染液染色、脫水透明封片等處理，在顯微鏡下觀測(cè)組織形態(tài)學(xué)改變并拍照。

2.3.2 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、TRAF6、NF-κB蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blotting法。取“2.2”項(xiàng)下各組大鼠結(jié)腸組織40 mg，放入2 mL離心管，按照RIPA裂解液說(shuō)明書(shū)方法提取相關(guān)蛋白，勻漿至無(wú)沉淀，以12 000 r/min離心5 min，取上清液采用BCA法測(cè)定蛋白含量并定量至2 μg/μL。蛋白于100 ℃變性10 min，取變性后的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用8%脫脂奶粉室溫封閉3 h。加入相應(yīng)一抗[TLR4（稀釋度為1 ∶ 2 000）、TRAF6（稀釋度為1 ∶ 2 000）、NF-κB（稀釋度為1 ∶ 2 000）、GAPDH（稀釋度為1 ∶ 2 000）]，37 ℃孵育12 h;以TBST洗膜15 min×3次，加入IgG二抗（稀釋度為1 ∶ 4 000），37 ℃ 孵育1 h，以TBST洗膜15 min×3次。以ECL顯色后，于凝膠成像儀中進(jìn)行曝光成像后，采用Image J 1.51軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.3.3 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、TRAF6、TNF-α、NF-κB mRNA水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）法。取“2.2”項(xiàng)下各組大鼠結(jié)腸組織適量，剪碎后放入2 mL離心管，加入 Triquick Reagent總RNA提取試劑1 mL，勻漿至無(wú)沉淀，靜置5 min后加入氯仿0.2 mL，振蕩15 s;于4 ℃下以4 500 r/min離心15 min后，取上清液0.5 mL加至另一1.5 mL離心管中;加入異丙醇0.5 mL，置于室溫下靜置10 min;重復(fù)上述步驟3次，棄上清液。沉淀于65 ℃金屬浴鍋中烘干，加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水0.03 mL溶解，經(jīng)超微量核酸檢測(cè)儀測(cè)定RNA濃度并按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將所得cDNA置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，待用。RT-PCR反應(yīng)體系為MonAmpTM SYBR? Green qPCR Mix 10 μL，cDNA 1 μL，正向引物（10 μmol/L）0.4 μL，反向引物（10 μmol/L）0.4 μL，H2O 8.2 μL;反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目標(biāo)基因mRNA的表達(dá)水平（式中Ct表示熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)）。引物序列詳見(jiàn)表1。

2.3.4 各組大鼠血清中相關(guān)炎癥因子以及糞便樣品中FC水平檢測(cè) 采用ELISA法。取“2.2”項(xiàng)下血清/糞便樣品適量，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)各組大鼠血清中TNF-α、IL-6以及糞便樣品中FC的水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠結(jié)腸組織的病理改變

與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織黏膜表面嚴(yán)重缺損，可見(jiàn)深達(dá)肌層的潰瘍壞死。經(jīng)藥物治療后，安腸湯低劑量組大鼠結(jié)腸組織黏膜表面較模型組稍有改善，但仍可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);而安腸湯中、高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織恢復(fù)明顯，其黏膜表面可見(jiàn)新生腺體且排列較整齊。詳見(jiàn)圖1。

3.2 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、TRAF6、NF-κB蛋白表達(dá)水平

與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、TRAF6、NF-κB蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，各藥物組大鼠結(jié)腸組織中上述指標(biāo)的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），詳見(jiàn)表2、圖2。

3.3 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、TRAF6、TNF-α、NF-κB mRNA表達(dá)水平

與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、TRAF6、TNF-α、NF-κB mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0. 05）;與模型組比較，各藥物組大鼠結(jié)腸組織中上述指標(biāo)的表達(dá)水平均顯著降低（P<0. 05），詳見(jiàn)表3。

3.4 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6及糞便樣品中FC的水平

與空白組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6及糞便樣品中FC水平均顯著升高（P<0. 05）;與模型組比較，各藥物組大鼠血清/糞便中上述指標(biāo)水平均顯著降低（P<0.05），詳見(jiàn)表4。

4 討論

目前，UC的病因和發(fā)病機(jī)制仍未明確，但近年的研究熱點(diǎn)聚焦在免疫炎癥反應(yīng)的相關(guān)通路上，如NF-κB信號(hào)通路、TLR信號(hào)通路等分泌的炎癥因子，被證實(shí)與UC的炎癥程度密切相關(guān)[9-11]。NF-κB是一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，在靜息狀態(tài)下因NF-κB/Rel蛋白二聚體與抑制蛋白IκB結(jié)合而處于失活狀態(tài)[12];而TLR4屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白受體，在細(xì)胞表面能夠識(shí)別病原相關(guān)分子，在活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到橋梁作用[13-14]。當(dāng)TLR4/NF-κB信號(hào)通路被異己抗原激活后，其細(xì)胞表面受體會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，激活激酶1和代謝性炎癥的IκK復(fù)合物使其磷酸化，并由泛素連接酶引導(dǎo)，從而可被泛素化和被溶酶體識(shí)別并降解，于是NF-κB從NF-κB抑制因子α（IκBα）重組蛋白復(fù)合物中脫離出來(lái)，暴露出核定位域，且迅速發(fā)生核轉(zhuǎn)位，通過(guò)與EB病毒靶基因反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)了相關(guān)炎癥因子（如TNF-α、脂多糖、IL-1、過(guò)氧化氫等）的表達(dá)[15];而產(chǎn)生的炎癥因子又進(jìn)一步激活NF-κB，從而形成惡性循環(huán)，使病情不斷惡化。牛亞蒙等[16]在研究?jī)?nèi)毒素性肝損傷時(shí)發(fā)現(xiàn)，解毒化瘀通腑方可抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活，減少炎癥因子的釋放，減輕內(nèi)毒素引起的肝損害。段紫鈺等[17]基于TLR4/髓樣分化因子（MyD88）/NF-κB通路的研究發(fā)現(xiàn)，雙草油對(duì)大鼠放射性皮炎能起到一定的保護(hù)作用。董小鵬等[18]研究表明，血必凈注射液能降低TLR4、NF-κB、TNF-α蛋白的表達(dá)水平，從而抑制肺組織炎癥反應(yīng)。由此可見(jiàn)，TLR4/NF-κB信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控炎癥因子的表達(dá)在疾病發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。

TNF受體相關(guān)因子TRAFs家族成員包括TRAF1～7，其是一類(lèi)能直接或間接與多種TNF和IL-1/TLRs結(jié)合的接頭蛋白，介導(dǎo)多種下游信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和死亡[19-20];此外，TRAF2～7的N-末端存在一個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)域，可作為E3泛素連接酶將泛素轉(zhuǎn)移到目的蛋白上[21]。Deng等[22]研究表明，TRAF6可與E3以及泛素連接酶Ubc13/Uev1A結(jié)合形成多聚泛素鏈，使IκB發(fā)生磷酸化，從而激活NF-κB信號(hào)通路。陳華群等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在NF-κB信號(hào)通路激活過(guò)程中，TRAF6發(fā)生降解，且該降解是由蛋白酶復(fù)合體介導(dǎo)的，提示TRAF6可能是通過(guò)自身的泛素化及蛋白酶降解來(lái)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的。吳曉丹[24]研究認(rèn)為，高糖條件下能激活高遷移率族蛋白B1（HMGB1）/TLR4/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路，引起細(xì)胞自噬從而造成心肌細(xì)胞的損傷。Ahmedy等[25]研究認(rèn)為，蜂毒肽可通過(guò)TLR4/TRAF6介導(dǎo)的NF-κB和應(yīng)激激活的p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）途徑來(lái)減輕乙酸誘發(fā)的小鼠UC。Yang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可通過(guò)TLR4/TRAF6/ NF-κB信號(hào)通路而減輕腦出血引起的神經(jīng)炎癥。

1980年，Dale等[27]首次從中性粒細(xì)胞中分離出FC，是一種新型的炎癥標(biāo)志物。林麗琳等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在急性炎癥患者體內(nèi)FC表達(dá)水平增高，且比其他炎癥標(biāo)志物[如C-反應(yīng)蛋白（CRP）]更加穩(wěn)定。邢曄陳等[29]通過(guò)檢測(cè)克羅恩患者和健康體檢者的糞便樣本，發(fā)現(xiàn)克羅恩病患者的致病菌和FC的檢出率與豐度都顯著升高。

本研究病理研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠結(jié)腸組織黏膜表面嚴(yán)重缺損，可見(jiàn)深達(dá)肌層的潰瘍壞死。經(jīng)藥物治療后，安腸湯低劑量組黏膜表面較模型組稍有改善，但仍可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);而安腸湯中、高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠恢復(fù)明顯，黏膜表面可見(jiàn)新生腺體且排列較整齊。本研究還發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中TLR4、TRAF6、NF-κB蛋白表達(dá)水平，TLR4、TRAF6、TNF-α、NF-κB mRNA水平以及血清中TNF-α、IL-6和糞便樣品中FC水平均顯著升高;而經(jīng)藥物處理后，各藥物組大鼠上述指標(biāo)均較模型組顯著降低（P<0.05），尤以安腸湯中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組的結(jié)果變化明顯。這提示經(jīng)安腸湯和雙歧桿菌活菌膠囊治療后，UC模型大鼠的炎癥反應(yīng)得到改善。同時(shí)，本研究中以雙歧桿菌活菌膠囊作為陽(yáng)性對(duì)照，以排除使用安腸湯干預(yù)后可能出現(xiàn)的假陰性情況，結(jié)果表明，兩藥都能抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路及FC的表達(dá)。

綜上所述，安腸湯可緩解UC模型大鼠的炎癥發(fā)炎，促進(jìn)腸道組織黏膜的修復(fù)，其作用機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路及FC的表達(dá)有關(guān);但因?qū)嶒?yàn)條件有限，筆者尚未深入探討安腸湯與TLR4/NF-κB信號(hào)通路的具體藥效機(jī)制，有待后續(xù)研究加以完善。

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（收稿日期：2020-07-06 修回日期：2020-12-17）

（編輯：羅 瑞）