羅德艷，馮俊，彭濤，唐一萍，楊久梅

川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院，四川南充637000

喉癌屬頭頸部惡性腫瘤，其主要病理學(xué)類型為喉鱗狀細(xì)胞癌（鱗癌），該病早期診斷率低、長(zhǎng)期生存率不高，且癌細(xì)胞增殖、侵襲是造成治療失敗的重要原因［1］。因此，探索喉鱗癌特異性分子標(biāo)志物和有效的基因治療靶點(diǎn)，對(duì)喉鱗癌早期診治、有效治療尤為重要。近年來(lái)研究表明，微小RNA（miRNA）在惡性腫瘤早期診斷、靶向治療、預(yù)后評(píng)估等方面有良好應(yīng)用前景［2］。miR-204 是 miRNA 成員之一，已有研究發(fā)現(xiàn)其在肝癌［3］、前列腺癌［4］、胃癌［5］、宮頸癌［6］等多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-204 表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但目前國(guó)內(nèi)外缺乏關(guān)于miR-204 與喉鱗癌的研究，并且有待進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。因此，2020 年4—7 月，本研究通過(guò)觀察miR-204 過(guò)表達(dá)對(duì)喉鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以期為喉鱗癌的靶向治療提供新思路。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人喉鱗癌細(xì)胞株Hep-2 由華西醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng)；RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司；LipofectamineTM2000、TRIzol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR 試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；miR-204 mimics及NC-mimics購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；miR-204 及U6 引物購(gòu)自蘇州金唯智生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)股份有限公司；CCK8 試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；一抗高遷移率組蛋白A2（HMGA2）和 GAPDH 抗體均購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz 公司；HRP 標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Bioworld 公司；Tran?swell 小室購(gòu)自美國(guó) Corning 公司；基質(zhì)膠、FACSCali?bur 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司；Light Cycler 480 PCR儀購(gòu)自瑞士ROCHE公司；Synergy 4多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio Tek公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將Hep-2 細(xì)胞培養(yǎng)在RP?MI1640 培養(yǎng)基（含胎牛血清10%、鏈霉素、青霉素）中，培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞隨機(jī)分為miR-204 模擬物組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組，根據(jù)Lipofectami?neTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明進(jìn)行操作，miR-204模擬物組和陰性對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染miR-204 mimics（使miR-204過(guò)表達(dá)）和 NC-mimics（miR-204 mimics 的陰性對(duì)照），空白對(duì)照組不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。。

1.3 Hep-2 細(xì)胞中miR-204 表達(dá)檢測(cè) 采用qRTPCR法。轉(zhuǎn)染后24 h，根據(jù)TRIzol法提取Hep-2細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定含量、純度，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，加入引物，進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。miR-204 上游引物序列5'-TG?GTTTTTTTTTAAATTAAGTTAGTAAAGT-3'，下 游引物序列5'-ACAACCTACACAAAACAACCTATA?ATC-3'。內(nèi)參U6 上游引物序列5'-CTCGCTTCG?GCAGCACA-3'，下 游 引 物序列 5'-AACGCTTCAC?GAATTTGCGT-3'。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性 20 s、60 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s，40 個(gè)循環(huán)。以 U6 為內(nèi)參，采用 2-??Ct法計(jì)算 miR-204 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Hep-2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) CCK8 實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染后24 h，取各組細(xì)胞，以100 μL/孔（約1×104個(gè)細(xì)胞）將細(xì)胞接種于96孔板中，各組設(shè)立6個(gè)平行孔，培養(yǎng)24、48、72 h 后，各孔加入 CCK8 試劑10 μL，繼續(xù)于37 ℃培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（OD）值，以O(shè)D值代表細(xì)胞增殖能力。

1.5 Hep-2 細(xì)胞克隆能力檢測(cè) 采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)。取轉(zhuǎn)染24 h 后的各組細(xì)胞，胰酶消化，PBS洗滌，加入RPMI1640 培養(yǎng)基中，制備細(xì)胞懸液；稀釋后每組以600個(gè)細(xì)胞/孔的密度，接種到6孔板；培養(yǎng)14 d，用PBS 洗滌，多聚甲醛4%固定15 min，清除固定液，細(xì)胞染色20 min，去染色液，室溫干燥；顯微鏡下觀察克隆，超于50 個(gè)細(xì)胞的集落表示為1 個(gè)克隆，計(jì)數(shù)克隆數(shù)。

1.6 Hep-2 細(xì)胞周期測(cè)定 采用流式細(xì)胞術(shù)。轉(zhuǎn)染后24 h，取各組細(xì)胞，用PBS 洗滌，加70%預(yù)冷乙醇4 ℃固定；隔夜后離心，分離乙醇，去上清，PBS 洗滌，加碘化丙啶50 μg/mL、RNase 50 μg/mL，4 ℃避光染色30 min。用流式細(xì)胞儀統(tǒng)計(jì)各周期細(xì)胞，計(jì)算G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。

1.7 Hep-2細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞術(shù)。轉(zhuǎn)染后24 h，各組取1×105個(gè)細(xì)胞，離心5 min（1 000 r/min，離心半徑10 cm），去上清液，加入結(jié)合液500 μL 重懸細(xì)胞；后加入 Annexin V-FITC 5 μL 混勻，加入Propidium Iodide 5 μL 混勻，室溫孵育15 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.8 Hep-2 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell 實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染后24 h，取各組細(xì)胞，采用無(wú)血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，取含 2×105個(gè)細(xì)胞（200 μL 單細(xì)胞懸液）加于預(yù)鋪基質(zhì)膠的Transwell 小室上室，將含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基500 μL 加入下室，孵育24 h，取出小室，輕微擦拭上室細(xì)胞，除去未穿膜的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定，染色、風(fēng)干，顯微鏡（×100）觀察，隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.9 Hep-2 細(xì)胞內(nèi)HMGA2 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting 法。轉(zhuǎn)染后24 h，取各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。取50 μg 總蛋白，應(yīng)用10% SDS-PAGE 分離蛋白，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，用含有5%脫脂牛奶的封閉液在4 ℃條件下浸泡膜4 h，加入一抗HMGA2（1∶1 000 稀釋）和GAPDH（1∶2 000 稀釋），4 ℃條件下孵育過(guò)夜，TBS緩沖液洗膜后加入二抗IgG，在室溫條件下繼續(xù)反應(yīng)2 h，ECL 顯影液顯影。HMGA2蛋白相對(duì)表達(dá)量=HMGA2條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，三組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組轉(zhuǎn)染后miR-204 表達(dá)比較 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-204模擬物組miR-204相對(duì)表達(dá)量分別為 0.97 ± 0.10、1.01 ± 0.09、10.54 ± 0.49。miR-204 模擬物組miR-204 相對(duì)表達(dá)量高于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（P均<0.05），而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組miR-204 相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 miR-204 過(guò)表達(dá)對(duì)Hep-2 細(xì)胞增殖能力的影響 培養(yǎng)24、48、72 h，miR-204 模擬物組OD 值均低于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（P均<0.05），空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)OD 值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 三組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力比較（±s）

表1 三組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較，#P<0.05。

組別空白對(duì)照組陰性對(duì)照組miR-204模擬物組OD值培養(yǎng)24 h 0.682±0.081 0.692±0.077 0.456±0.062*#培養(yǎng)48 h 1.158±0.142 1.189±0.123 0.747±0.108*#培養(yǎng)72 h 1.841±0.158 1.955±0.196 1.075±0.140*#

2.3 miR-204過(guò)表達(dá)對(duì)Hep-2細(xì)胞克隆形成能力的影響 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-204 模擬物組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組細(xì)胞克隆數(shù)分別為（120 ± 23）、（117 ± 18）、（55 ± 10）個(gè)。miR-204 模擬物組細(xì)胞克隆數(shù)低于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（P均<0.05），空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組細(xì)胞克隆數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 miR-204 過(guò)表達(dá)對(duì)Hep-2 細(xì)胞周期的影響miR-204 模擬物組G0/G1期細(xì)胞比例高于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（P均<0.05），S 期、G2/M 期細(xì)胞比例低于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（P均<0.05）；空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組細(xì)胞周期分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞周期分布比較（%，±s）

表2 各組細(xì)胞周期分布比較（%，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與陰性對(duì)照組比較，#P<0.05。

組別空白對(duì)照組陰性對(duì)照組miR-204模擬物組Hep-2細(xì)胞G0/G1期44.95±7.26 46.62±7.59 68.19±9.45*#S期30.02±5.38 29.14±5.12 17.76±3.35*#G2/M期25.03±5.27 24.24±5.08 14.05±2.73*#

2.5 miR-204過(guò)表達(dá)對(duì)Hep-2細(xì)胞凋亡的影響 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-204 模擬物組細(xì)胞凋亡率分別為（4.87±1.89）%、（5.01±2.01）%、（21.64±4.89）%。miR-204 模擬物組細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（P均<0.05），而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.6 miR-204 過(guò)表達(dá)對(duì)Hep-2 細(xì)胞侵襲能力的影響 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-204 模擬物組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（200± 28）、（195± 25）、（103± 17）個(gè)。miR-204 模擬物組穿膜細(xì)胞數(shù)低于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（P均<0.05），而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.7 miR-204 過(guò)表達(dá)對(duì) Hep-2 細(xì)胞 HMGA2 蛋白表達(dá)的影響 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-204 模擬物組HMGA2 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.99 ± 0.09、1.02± 0.11、0.39± 0.14。miR-204 模擬物組Hep-2細(xì)胞HMGA2 蛋白相對(duì)表達(dá)量低于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（P均<0.05），而空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組HMGA2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

miRNA 是特異性結(jié)合靶基因mRNA 的非編碼小分子RNA，長(zhǎng)20～25 個(gè)核苷酸，可引起靶基因mRNA 降解或抑制其翻譯，從而達(dá)到調(diào)控下游基因的作用。目前認(rèn)為，miRNA 廣泛參與機(jī)體的生物學(xué)行為，與惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后關(guān)系密切。許多異常表達(dá)的miRNA 在喉癌發(fā)生發(fā)展中起著癌基因或抑癌基因作用，可能為喉癌的靶向治療提供新的方向。

miR-204 是miRNA 家族重要的成員，其編碼基因位于人9 號(hào)染色體，研究發(fā)現(xiàn)其可能成為新的抑癌基因。研究發(fā)現(xiàn)，miR-204 過(guò)表達(dá)可促使色素上皮衍生因子失控，誘發(fā)前列腺癌［7-8］。而在頭頸部鱗癌細(xì)胞中miR-204 過(guò)表達(dá)能夠抑制腫瘤靶基因水平，并抑制細(xì)胞遷移、侵襲，發(fā)揮抑癌作用［9］。目前miR-204 在非小細(xì)胞肺癌［10］、卵巢癌［11］等腫瘤中的研究均發(fā)現(xiàn)，miR-204 過(guò)表達(dá)具有明確的抑癌作用。研究表明，miR-204 表達(dá)與p-STAT3 和抗凋亡基因Bcl-2 呈負(fù)相關(guān)，miR-204 過(guò)表達(dá)可抑制癌癥細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］。但目前關(guān)于miR-204 對(duì)喉鱗癌的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。本研究結(jié)果顯示，miR-204過(guò)表達(dá)能抑制喉鱗癌Hep-2細(xì)胞增殖活性，同時(shí)降低細(xì)胞克隆形成能力；miR-204 過(guò)表達(dá)能夠?qū)⒑眵[癌Hep-2 細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡；并且miR-204 過(guò)表達(dá)能夠抑制喉鱗癌Hep-2 細(xì)胞的侵襲。以上提示miR-204 可能作為一種抑癌基因參與喉鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

HMGA2是高遷移率族蛋白超家族成員之一，其定位于人染色體12q13-15。HMGA2 在人正常組織中不表達(dá)或者表達(dá)極低，但是其在胚胎組織和人類許多惡性腫瘤組織中表達(dá)異常增高［12］。既往研究表明，HMGA2在絕大多數(shù)惡性腫瘤中作為癌基因發(fā)揮促癌作用［13］。研究已經(jīng)證實(shí)HMGA2 在喉鱗癌細(xì)胞和組織中表達(dá)異常增高，抑制喉鱗癌細(xì)胞HMGA2能夠抑制癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力，并促進(jìn)其凋亡［14-17］。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-204 在結(jié)腸癌［18］和甲狀腺癌［19］中均能夠通過(guò)調(diào)控HMGA2 發(fā)揮抑癌作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-204過(guò)表達(dá)能夠明顯抑制Hep-2細(xì)胞中HMGA2 蛋白的表達(dá)，提示miR-204 過(guò)表達(dá)對(duì)Hep-2 細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期及侵襲的影響可能與其對(duì)HMGA2蛋白表達(dá)的抑制作用有關(guān)。

綜上所述，miR-204 過(guò)表達(dá)能夠?qū)⒑眵[癌Hep-2細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與其對(duì)HMGA2 表達(dá)調(diào)控有關(guān)。這可能成為喉鱗癌的潛在治療靶點(diǎn)，為臨床診治提供新的方向。