錢曉芬，吳濤，趙理想，孫杰，汪釗，魏春

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)

牛乳鐵蛋白(bovine lactoferrin, Blf)是一種非血紅素鐵結(jié)合蛋白，由689個氨基酸組成的單一多肽鏈，分子質(zhì)量為77 kDa，具有廣譜的抗菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及參與免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性[1-5]，在食品添加劑、飼料添加劑、醫(yī)藥行業(yè)中已有廣泛的應(yīng)用[6-9]。牛乳鐵蛋白目前主要從牛乳中提取制得，生產(chǎn)成本高。重組微生物發(fā)酵生產(chǎn)牛乳鐵蛋白是一種降低牛乳鐵蛋白生產(chǎn)成本的極具潛力的方法。畢赤酵母易于高密度發(fā)酵培養(yǎng)，AOX1啟動子強(qiáng)勁，且具有真核細(xì)胞翻譯后折疊修飾、加工、糖基化等功能，是表達(dá)牛乳鐵蛋白的優(yōu)良宿主[10-16]。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白功能片段(包括2個功能結(jié)構(gòu)域的1～333氨基酸序列，bovine lactoferrin functional fragment, BlfFf)的重組畢赤酵母，但表達(dá)量有待提高[17]。增加基因拷貝數(shù)是提高重組蛋白表達(dá)的最有效手段之一，而核糖體rDNA非轉(zhuǎn)錄基因間隔區(qū)NTS(non-transcribed spacer)同源整合以及PTVA(posttransformational vector amplification)法是獲得多拷貝重組菌株的常用手段[18-20]。HAC1基因編碼的Hac1p蛋白是酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白響應(yīng)(unfolded protein response, UPR)機(jī)制的激活因子，因而多拷貝HAC1基因也是提高表達(dá)量的有效方法[21-23]。因此本研究在先前工作基礎(chǔ)上，進(jìn)行HAC1等輔助表達(dá)基因的導(dǎo)入及多拷貝重組菌的構(gòu)建及篩選，并借助流式細(xì)胞術(shù)檢測酵母存活率[24-25]，以研究基因多拷貝的影響和提高BlfFf表達(dá)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

宿主菌PichiapastorisGS115，本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；BlfFfG01重組菌及質(zhì)粒pPICZαA -P0547-Kex2-2A-HAC1由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[17, 21]；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,唯地生物。

1.1.2 試劑

DNA限制性內(nèi)切酶、DNA marker,TaKaRa公司；博來霉素(zeocin)、潮霉素B(hygromycin B)、質(zhì)粒抽提試劑盒、酵母基因組提取試劑盒、四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)顯色液，上海生工；分子量蛋白marker、牛血清白蛋白(bull serum albumin，BSA)、聚偏氟乙烯膜，索萊寶公司；Anti-6-His單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，浩克生物公司；Anti-6-His-tag親和層析柱(His-Trap HP)，GE公司產(chǎn)品；His Tag ELISA Detection Kit試劑盒，南京金斯瑞公司；qPCR試劑SYRB Green Realtime PCR Master，諾韋贊生物公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB、YPD、MD、BMGY與BMMY配方參照Invitrogen公司的《畢赤酵母表達(dá)操作手冊》。高密度發(fā)酵BSM培養(yǎng)基參照PichiaFermentation Guidelines (Version B，053002，Invitrogen)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BlfFfG系列菌株的構(gòu)建

將提取的pPICZαA-P0547-Kex2-2A-HAC1重組質(zhì)粒用pmeΙ線性化后電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入BlfFfG01感受態(tài)細(xì)胞，涂含zeocin抗性的YPDS平板篩選轉(zhuǎn)化子，篩得重組菌BlfFfG02。

以重組質(zhì)粒pPIC9K-BlfFf為模板[17]，PCR擴(kuò)增PAOX1-BlfFf片段；以畢赤酵母GS115基因組為模板，PCR擴(kuò)增核糖體rDNA非轉(zhuǎn)錄基因間隔區(qū)NTS的rDNA1、rDNA2片段；以質(zhì)粒pPICZαA為模板，PCR擴(kuò)增PTEF1-EM7啟動子片段；以Streptomyceshygroscopicus基因組為模板，PCR擴(kuò)增潮霉素抗性基因。由上述5個片段經(jīng)過Overlap PCR融合而成rDNA-NTS-BlfFf克隆表達(dá)盒。各片段組成及摩爾比為rDNA1∶BlfFf∶PTEF1-EM7∶HyB∶rDNA2=1∶3∶5∶3∶1。將此表達(dá)盒轉(zhuǎn)化BlfFfG02菌株，以潮霉素B抗性平板篩選得到BlfFfG03重組菌株。

PTVA法擴(kuò)增BlfFf基因拷貝數(shù)：以BlfFfG03重組菌株為出發(fā)菌株，參照AW等[20]的方法，以潮霉素B抗性梯度離心管連續(xù)進(jìn)行離心轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，最后稀釋涂布到含6 mg/mL潮霉素B的YPD平板上培養(yǎng)，篩選到不同BlfFf基因拷貝數(shù)的菌株，并經(jīng)搖瓶比較、篩選得到最高BlfFf表達(dá)量的重組畢赤酵母菌株BlfFfG10。

PTVA法擴(kuò)增HAC1基因拷貝數(shù)：同上方法，以BlfFfG10為出菌株，以zeocin抗性梯度離心管連續(xù)進(jìn)行離心轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，最后稀釋涂布到含3 mg/mL zeocin的YPD平板上篩選到不同HAC1基因拷貝數(shù)的重組菌株。

BlfFfG系列菌株中的BlfFf和HAC1基因拷貝數(shù)通過熒光定量PCR方法測定[26]。

1.2.2 重組畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)

將GS115-pPIC9K及BlfFfG系列菌株單菌落接種于BMGY中，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)18 h(OD600≈2～6)，離心收集菌體，用適量的BMMY培養(yǎng)基懸浮菌體，接種于BMMY使其初始OD600=1.0，于30 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)96 h，每24 h添加100%(體積分?jǐn)?shù))甲醇，誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)為0.5%。誘導(dǎo)結(jié)束離心取上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

取1 mL誘導(dǎo)96 h發(fā)酵上清液，以甲醇-氯仿法濃縮、沉淀蛋白，用40 μL去離子水溶解蛋白，加入SDS上樣緩沖液后煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot分析。轉(zhuǎn)印后的膜用0.5%(體積分?jǐn)?shù))的BSA封閉1 h，加入Anti-6-His單克隆抗體孵育1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered solution tween-20，PBST)漂洗3次，10 min/次，再以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗孵育1 h，PBST漂洗3次后，用TMB顯色。

1.2.4 牛乳鐵蛋白功能片段的ELISA定量檢測

牛乳鐵蛋白功能片段定量測定按照南京金斯瑞公司His Tag ELISA Detection Kit試劑盒說明書操作。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)分析酵母存活率

以流式細(xì)胞儀(FACSMelodyTM，美國BD公司)測定。取發(fā)酵末的畢赤酵母發(fā)酵液25 μL，加4 ℃預(yù)冷的PBS 1 mL，用振蕩器振勻，離心去上清液，用PBS清洗2次菌體，再加1 mL PBS，用振蕩器振勻，以20 kHz超聲10 s以分散細(xì)胞。然后再加入PBS 0.5 mL和碘化丙錠(PI)50 μL(PI終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，PI母液1 mg/mL，用PBS溶解)，避光振搖5 min。PI染色后的樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋，在4 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定。數(shù)據(jù)采用FlowJo軟件處理。

1.2.6 5 L罐高密度發(fā)酵

挑選搖瓶表達(dá)量最大的菌株用于高密度發(fā)酵，以10%接種量接入含3 L BSM培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐，以自動控制流氨維持pH 5.0，全程發(fā)酵溫度控制在30 ℃，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速與通氣量控制溶氧在20%以上。當(dāng)培養(yǎng)基中甘油消耗完后，溶氧快速上升(DO>60%)，隨即開始流加含有PTM1的50%甘油200 mL，流速50 mL/h。流加結(jié)束后饑餓30 min，流加含有PTM1的100%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，控制比生長速率在0.01 h-1左右，誘導(dǎo)后每12 h分別取樣，測定目的蛋白含量與菌體濕重。

2 結(jié)果與分析

2.1 HAC1基因?qū)爰癇lfFf基因多拷貝重組菌株的構(gòu)建

在已經(jīng)構(gòu)建得到的BlfFf基因單拷貝重組畢赤酵母BlfFfG01菌株基礎(chǔ)上[17]，將HAC1、Kex2(信號肽切割酶基因)基因按照已建立的方法[21]轉(zhuǎn)入重組畢赤酵母BlfFfG01，篩選得到BlfFfG02號菌株。該菌株表達(dá)量相比BlfFfG01有所提高，但提高幅度不大。由于BlfFfG02菌株的BlfFf、HAC1基因均只有1拷貝，而拷貝數(shù)對于基因的高效表達(dá)具有顯著影響，因此，利用核糖體rDNA的 NTS同源整合的方法結(jié)合PTVA技術(shù)來提高重組菌株中的基因拷貝數(shù)。將rDNA-NTS-BlfFf克隆表達(dá)盒整合到BlfFfG02號菌株的NTS區(qū)域，篩選獲得BlfFfG03菌株。進(jìn)一步以BlfFfG03菌株為出發(fā)菌株，利用PTVA技術(shù)擴(kuò)增拷貝數(shù)，篩選到不同BlfFf基因拷貝數(shù)的菌株。各菌株基因拷貝數(shù)如表1所示。

表1 BlfFfG系列菌株中BlfFf基因和HAC1基因拷貝數(shù)Table 1 Gene copies of BlfFf and HAC1 in BlfFfG series strains

2.2 BlfFf基因多拷貝重組菌株的蛋白表達(dá)比較

對BlfFfG01-10系列菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵上清進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot分析，結(jié)果如圖1所示。

M-蛋白Marker；1-對照(GS115-pPIC9K)的誘導(dǎo)表達(dá)上清；2～11-BlfFfG01-10系列菌株的誘導(dǎo)表達(dá)上清A-SDS-PAGE分析；B-Western Blot分析圖1 不同BlfFf基因拷貝數(shù)菌株誘導(dǎo)表達(dá)上清的SDS-PAGE和Western BlotFig.1 Analysis of SDS-PAGE and Western Blot on expression products from the recombinant strains with different copies number of BlfFf gene

圖1中，陰性對照GS115-pPIC9K菌株搖瓶發(fā)酵上清對應(yīng)的37 kDa分子質(zhì)量處未見特異性條帶產(chǎn)生。結(jié)合圖像條帶灰度比較，由圖1中泳道3～11中37 kDa處目的條帶的顏色深淺變化尤其是Western Blot特異性顯色趨勢， 可以看出隨著BlfFf基因拷貝數(shù)的增加，BlfFf蛋白表達(dá)量也隨之增加，表明拷貝數(shù)對產(chǎn)量影響顯著。泳道2和泳道3比較表明，HAC1基因的導(dǎo)入有助于BlfFf表達(dá)量的提高。在BlfFf基因高拷貝情況下，細(xì)胞內(nèi)部蛋白翻譯、折疊、修飾、分泌的壓力會增加，可能引起UPR，這時候?qū)氲膯慰截怘AC1基因劑量可能不足以應(yīng)對UPR。增強(qiáng)HAC1基因劑量有助于緩解細(xì)胞蛋白表達(dá)機(jī)器的壓力。因此，對表達(dá)量最高的BlfFfG10號菌株進(jìn)一步應(yīng)用PTVA法處理以擴(kuò)增HAC1基因的拷貝數(shù)。

2.3 HAC1基因多拷貝重組菌株的構(gòu)建及BlfFf蛋白表達(dá)比較

運(yùn)用PTVA法獲得HAC1拷貝數(shù)分別為2、3、4的菌株，命名為BlfFfG11(BlfFf基因拷貝數(shù)11、HAC1基因拷貝數(shù)2)、BlfFfG12(BlfFf基因拷貝數(shù)11、HAC1基因拷貝數(shù)3)、BlfFfG13(BlfFf基因拷貝數(shù)11、HAC1基因拷貝數(shù)4)。對BlfFfG02、10-13系列菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，取上清進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot分析，結(jié)果見圖2。

M-蛋白marker；1-對照(GS115-pPICZαA)的表達(dá)上清；2-BlfFfG10菌株的表達(dá)上清；3-BlfFfG02菌株的表達(dá)上清；4～6-BlfFfG11-13菌株的表達(dá)上清A-SDS-PAGE分析；B-Western Blot分析圖2 不同HAC1基因拷貝數(shù)菌株表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western BlotFig.2 SDS-PAGE and Western Blot of expression products of different HAC1 gene copies number

2、4、5、6泳道條帶的分析表明，HAC1基因拷貝數(shù)由1增加到3時，BlfFf的表達(dá)水平也隨之提高，但當(dāng)HAC1基因拷貝數(shù)為4時，BlfFf的表達(dá)水平反而下降了。這一結(jié)果表明，HAC1基因拷貝數(shù)過多，增加了新的限制表達(dá)因素。

2.4 基因拷貝數(shù)對重組菌株BlfFf的表達(dá)水平及細(xì)胞存活率的影響

為更準(zhǔn)確地比較基因拷貝數(shù)的影響，對以上系列菌株的搖瓶發(fā)酵樣品進(jìn)行了BlfFf表達(dá)水平的ELISA檢測(圖3)以及應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測了發(fā)酵末菌體的存活率(圖4)。

圖3 BlfFfG系列菌株的重組蛋白產(chǎn)量比較Fig.3 Comparison of recombinant protein production between BlfFfG series strains

圖3中菌株BlfFfG03-10的重組蛋白產(chǎn)量比較表明，隨著目的基因BlfFf拷貝數(shù)增加，重組蛋白產(chǎn)量增加，但并非線性遞增。BlfFf基因拷貝數(shù)增加到6以后，表達(dá)量增加幅度越來越小，表明有其他影響重組蛋白表達(dá)的限制性因素存在。BlfFfG11與BlfFfG12的產(chǎn)量相比BlfFfG10分別提高了72%和150%，表明HAC1基因拷貝數(shù)的增加有力地解除了BlfFfG10菌株重組蛋白表達(dá)的部分限制性因素。推測是BlfFf基因11拷貝的BlfFfG10菌株增加的重組蛋白表達(dá)壓力在胞內(nèi)引發(fā)UPR，部分重組蛋白未正確折疊而被降解，而HAC1基因的增加，促使胞內(nèi)重組蛋白表達(dá)機(jī)器功能得以加強(qiáng)而減少了未折疊蛋白的產(chǎn)生。BlfFfG13菌株相比BlfFfG12，重組蛋白表達(dá)量反而減少，推測原因是外源導(dǎo)入的HAC1基因啟動子采用的是P0547甲醇誘導(dǎo)型啟動子[21]，與BlfFf基因的AOX1啟動子存在著轉(zhuǎn)錄因子等功能物質(zhì)利用的競爭關(guān)系，所以過多的HAC1基因拷貝數(shù)會負(fù)面影響B(tài)lfFf基因的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。

對于BlfFfG01-03、BlfFfG07、BlfFfG10和BlfFfG12菌株，誘導(dǎo)表達(dá)末期(發(fā)酵96 h)的細(xì)胞存活率如流式散點(diǎn)圖所示(圖4)。

A-BlfFfG01；B-BlfFfG02；C-BlfFfG03；D-BlfFfG07；E-BlfFfG10；F-BlfFfG12圖4 甲醇誘導(dǎo)96 h后細(xì)胞存活率的流式細(xì)胞儀檢測Fig.4 Flow cytometry detection of cell survival after 96 h of methanol induction

由圖4-A與圖4-B、圖4-E和圖4-F的分別對比分析可知，BlfFfG01的存活率為90.0%，導(dǎo)入HAC1基因后，BlfFfG02的存活率提高到92.8%；BlfFfG10存活率為50.5%，HAC1基因拷貝數(shù)增加到3后，BlfFfG12的存活率提高到56.5%。這一結(jié)果表明HAC1基因的導(dǎo)入對于酵母細(xì)胞存活率沒有負(fù)面影響，有一定的降低死亡率效果。BlfFfG03、BlfFfG07、BlfFfG10的存活率分別為91%、82.1%、50.5%，表明隨著BlfFf基因拷貝數(shù)增加，酵母細(xì)胞死亡率逐漸增加，存活率下降。因?yàn)锽lfFf基因拷貝數(shù)增加，BlfFf蛋白表達(dá)量也增加，所以細(xì)胞存活率與BlfFf蛋白表達(dá)量負(fù)相關(guān)。造成這一結(jié)果的原因可能是BlfFf蛋白的抑菌特性以及高拷貝基因條件下的誘導(dǎo)影響了甲醇代謝。

2.5 BlfFfG12菌株的5 L罐發(fā)酵

BlfFfG12菌株在5 L罐進(jìn)行高密度發(fā)酵，整個發(fā)酵過程的菌體濕重及BlfFf產(chǎn)量曲線如圖5所示。發(fā)酵培養(yǎng)120 h后，BlfFfG12的菌體濕重達(dá)403.8 g/L、BlfFf產(chǎn)量為120.7 mg/L。在發(fā)酵末期，BlfFf產(chǎn)量呈下降趨勢，推測這一現(xiàn)象與細(xì)胞死亡率不斷增加有關(guān)。發(fā)酵末期的酵母細(xì)胞死亡率達(dá)30%，破碎細(xì)胞釋放出的蛋白酶降解了部分BlfFf蛋白。因此，發(fā)酵96 h是最適發(fā)酵停止時間，此時BlfFf蛋白表達(dá)量為133.4 mg/L。

圖5 BlfFfG12菌株高密度發(fā)酵過程中菌體濕重及BlfFf蛋白產(chǎn)量變化曲線Fig.5 Time course of cell wet weight and BlfFf production during high-cell-density fermentation by BlfFfG12

3 結(jié)論

為了增強(qiáng)重組蛋白分泌表達(dá)效率，將HAC1、Kex2基因?qū)胫亟M畢赤酵母BlfFfG01并利用核糖體rDNA的NTS區(qū)域同源整合的方法結(jié)合PTVA技術(shù)來擴(kuò)增重組菌株中的BlfFf基因拷貝數(shù)。SDS-PAGE、Western Blot和ELISA分析表明，BlfFf產(chǎn)量隨著基因拷貝數(shù)的增加而增加，但并非線性遞增。BlfFf基因拷貝數(shù)增加到6以后，表達(dá)量增加幅度越來越小，表明有其他影響重組蛋白表達(dá)的限制性因素存在。進(jìn)一步以BlfFf基因11拷貝、HAC1基因1拷貝的BlfFfG10為出發(fā)菌株擴(kuò)增重組菌株中的HAC1基因拷貝數(shù)。HAC1基因拷貝數(shù)為3的BlfFfG12菌株產(chǎn)量相比BlfFfG10提高了150%，表明HAC1拷貝數(shù)增加強(qiáng)化了重組蛋白分泌表達(dá)效率。但更高的HAC1基因拷貝數(shù)反而降低了重組蛋白產(chǎn)量，有可能和HAC1基因的甲醇誘導(dǎo)型啟動子有關(guān)，改用組成型啟動子后擴(kuò)增HAC1拷貝數(shù)有可能進(jìn)一步提高產(chǎn)量。

流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)酵末期的酵母細(xì)胞存活率，結(jié)果表明隨著BlfFf基因拷貝數(shù)增加，重組菌株存活率下降。搖瓶培養(yǎng)中BlfFfG10菌株發(fā)酵末存活率僅為50.5%，原因有待進(jìn)一步探討。HAC1基因拷貝數(shù)增加可一定程度上提高重組菌株的存活率。通過發(fā)酵工藝優(yōu)化等措施提高高拷貝重組畢赤酵母的存活率，有望進(jìn)一步提高BlfFf產(chǎn)量。篩選得到產(chǎn)量最高的BlfFfG12菌株，在5 L罐進(jìn)行高密度發(fā)酵96 h，BlfFf蛋白表達(dá)量達(dá)133.4 mg/L，具備工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的潛力。