李澤洋,伍時(shí)華,龍秀鋒*,吳軍,易弋

1(廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州，545006)2(廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州，545006)3(廣西科技大學(xué)教學(xué)質(zhì)量監(jiān)控與評(píng)估中心，廣西 柳州，545006)

“曲為酒之骨”，酒曲在釀酒過程中發(fā)揮著重要作用，酒曲中具有不同功能的多種微生物將原料發(fā)酵成酒并使其具有獨(dú)特風(fēng)味[1-2]。微生物不能直接利用淀粉質(zhì)原料進(jìn)行發(fā)酵，酒曲中存在一類微生物，其產(chǎn)生的液化酶和糖化酶可將淀粉結(jié)構(gòu)中的α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵切斷，將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖等可發(fā)酵糖，從而提高淀粉利用率[3-5]，此過程稱為糖化；這類微生物稱之為糖化菌。酒曲中糖化菌種類眾多，如霉菌、細(xì)菌和一些酵母等，多數(shù)以霉菌為主[6-10]。酒曲中常見的霉菌包括曲霉屬(Aspergillus)[11]、根霉屬(Rhizopus)[12-13]、毛霉屬(Mucor)、犁頭霉屬(Absidia)[14]、青霉屬(Penicillium)[15-16]等，其中曲霉屬和根霉屬菌種與其他菌種相比糖化能力尤為突出[17]，在糧醅糖化過程中的作用十分顯著，廣泛應(yīng)用于大多數(shù)酒曲中[18-19]。部分糖化菌對(duì)釀酒起糖化作用的同時(shí)也兼具其他作用，如改善酒的口感，增加香氣物質(zhì)等，對(duì)釀造酒的風(fēng)味及風(fēng)格的形成都具有積極作用[20-21]。

為獲得在米酒釀造中淀粉糖化能力強(qiáng)的菌株，本研究采用孢子純化法從9種不同來源的酒曲中初篩得到純菌株，通過比較純菌株所制酒曲的液化力和糖化力復(fù)篩得到糖化能力突出的菌株，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，同時(shí)對(duì)菌株進(jìn)行試飯?jiān)囼?yàn)、蛋白酶活力測(cè)定及發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)分析。

1 材料與方法

1.1 原料

酒曲：通過多種途徑收集得到9種不同酒曲，詳細(xì)信息見表1;秈米(市售)、麩皮(網(wǎng)購)，無霉、無蛀保存完好。

表1 酒曲樣品信息Table 1 Information of the samples of Jiuqu

1.2 試劑

二氯甲烷、NaOH、CuSO4·5H2O、酒石酸鉀鈉、乳酸、乙酸、乙酸鈉、葡萄糖、三氯乙酸、Na2CO3、KI，西隴科學(xué)股份有限公司；可溶性淀粉(酶制劑行業(yè)檢測(cè)專用)，湖州展望藥業(yè)有限公司；福林酚試劑，福州文萊生物科技有限公司；L-酪氨酸、酪蛋白，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；碘，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乳酸鈉，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，切塊沸水加熱20 min，8層紗布過濾取濾液，20 g葡萄糖，15 g瓊脂加熱溶解，加水補(bǔ)足至1 000 mL，自然pH，高壓蒸汽115 ℃滅菌20 min。

麩皮培養(yǎng)基：m(麩皮)∶m(水)=1∶0.8，每20 g麩皮分裝至500 mL三角瓶，高壓蒸汽121 ℃滅菌20 min，滅菌完畢振蕩三角瓶，確保麩皮培養(yǎng)基疏松不結(jié)塊。

米飯培養(yǎng)基：m(大米)∶m(水)=1∶3，每50 g米分裝至500 mL三角瓶，高壓蒸汽115 ℃滅菌20 min。

1.4 儀器與設(shè)備

UV-8000S紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；BX43生物顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司；pHS-25CW臺(tái)式酸度計(jì)，上海般特儀器制造有限公司；Tpersonal聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀，德國Biometra公司；DYY-6D電泳儀，濟(jì)南東儀實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；ZXSD-R1430生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-TB標(biāo)準(zhǔn)凈化工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LS-B35L-I立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；SBA生物傳感分析儀，濟(jì)南延和生物科技有限公司；TRACE 1300 ISQ QD 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP5-MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，賽默飛世爾科技有限公司。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 糖化菌的初篩

1.5.1.1 菌株的分離

稱取5.0 g曲粉(塊狀需研磨)溶于45 mL無菌水中，振蕩混勻2 min，靜置取上層菌(孢子)懸液，以10倍系列稀釋制備菌(孢子)懸液，分別取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7菌(孢子)懸液100 μL，涂布于PDA平板培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2～4 d，以點(diǎn)植法取具有典型糖化菌菌落特征的菌落孢子(曲霉、根霉)，接種到新的PDA平板中培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)2～4 d。

1.5.1.2 菌株的純化

將1.5.1.1中分離的菌株，以點(diǎn)植法接種培養(yǎng)多代，直至肉眼觀察所培養(yǎng)菌落無其他外觀雜菌干擾，做到初步純化。

使用解剖刀將菌落切割并移至50 mL無菌水中振蕩，紗布過濾除菌絲取孢子懸液，以10倍系列稀釋制備10-7、10-8、10-9孢子懸液，取100 μL孢子懸液涂布于PDA平板培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)，以一點(diǎn)為中心生長且不與其他菌落生長相連的單菌落視為純菌落(即此菌落為1個(gè)孢子生長繁殖而成)，每個(gè)平板生長的菌落控制在1～3個(gè)為宜，過多則菌落生長易相連難以純化，此時(shí)需繼續(xù)稀釋孢子懸液，防止孢子飛散繁殖，在整個(gè)平板所有菌落產(chǎn)孢子前，以接種針挑取菌絲于PDA斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)至產(chǎn)孢子后4 ℃保存。

1.5.2 糖化菌的復(fù)篩

將已純化的菌株制備孢子懸液，調(diào)整其濃度為1×107個(gè)/mL，按照1×107個(gè)/20g麩皮接種于麩皮培養(yǎng)基，均勻攪拌， 30 ℃培養(yǎng)3 d(每日扣瓶3次)，40 ℃烘干10 h，制成糖化曲，4 ℃密封保存。

參考QB/T 4257—2011中方法測(cè)定麩曲的液化力、糖化力[22]，進(jìn)行3次平行測(cè)定。

1.5.3 形態(tài)學(xué)鑒定

將復(fù)篩得到的菌株以點(diǎn)植法接種于PDA平板中，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)特征，并通過顯微鏡觀察其微觀形態(tài)，參考《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)其進(jìn)行判斷[23]。

1.5.4 分子生物學(xué)鑒定

1.5.4.1 DNA體外擴(kuò)增

引物：ITS1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)、ITS4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)。

PCR反應(yīng)體系：預(yù)混酶：25 μL；引物ITS1：2 μL；引物ITS4：2 μL；菌液：2 μL；ddH2O：19 μL。

擴(kuò)增條件：預(yù)變性：94 ℃、5 min；變性：94 ℃、1 min；退火：55 ℃、1 min；延伸：72 ℃、1 min；30個(gè)循環(huán)；延伸：72 ℃、10 min；4 ℃保存。

1.5.4.2 測(cè)序及鑒定

取50 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。選取電泳條帶大小在600 bp左右的樣品切膠回收，產(chǎn)物送至廣州賽默飛世爾科技公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交于美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，使用Mega 5.0軟件中鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并采用Bootstraping法評(píng)估其準(zhǔn)確度。

1.5.5 糖化試飯?jiān)囼?yàn)

1.5.5.1 試飯

稱取大米40 g，浸泡8 h，蒸米至熟而不爛，超凈臺(tái)內(nèi)放涼，稱重使米水質(zhì)量比達(dá)到1∶1.5，若質(zhì)量不足，均勻噴無菌水至米飯。以大米質(zhì)量的0.3%拌曲，移至500 mL無菌三角瓶培養(yǎng)，透氣膜包扎，30 ℃培養(yǎng)72 h，每隔12 h取糖化飯10 g，加水50 mL，高壓蒸汽100 ℃滅菌10 min，迅速冷卻，測(cè)定葡萄糖含量，進(jìn)行3次平行測(cè)定。

1.5.5.2 米飯總糖測(cè)定

取米水質(zhì)量比達(dá)到1∶1.5的米飯100 g打漿，添加0.1 mL液化酶，95 ℃液化2 h，降溫至65 ℃，添加0.5 mL糖化酶糖化2 h，液化、糖化過程中加水，防止水分蒸干，糖化完畢充分過濾定容至1 000 mL，測(cè)定葡萄糖含量，進(jìn)行3次平行測(cè)定。

1.5.6 蛋白酶活力測(cè)定

參考GB/T 23527—2009，測(cè)定復(fù)篩得到的菌株的酸性和中性蛋白酶活力[24]，進(jìn)行3次平行測(cè)定。

1.5.7 發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)分析

將篩選出的菌株制備孢子懸液，調(diào)整孢子懸液濃度為1×107個(gè)/mL，按照1×106個(gè)/g米接種到米飯培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)5 d，每日無菌條件下攪拌3次，11 000 r/min，4 ℃離心15 min，取30 mL上清液，分別加入30、20、10 mL二氯甲烷在搖床中(100 r/min)萃取1 h、30 min、10 min，分液漏斗取有機(jī)相，減壓濃縮至5 mL，使用GC-MS測(cè)定風(fēng)味物質(zhì)。

氣相色譜條件：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至180 ℃保持5 min，再以5 ℃/min升至260 ℃保持2 min；進(jìn)樣口溫度280 ℃；氦氣流速1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：離子源溫度300 ℃；傳輸通道溫度280 ℃；電離方式EI電離源；電子能量70 eV；質(zhì)譜掃描范圍40～600 amu。

1.5.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Origin、Excel對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖化菌初篩

目前普遍采用點(diǎn)植法純化霉菌，但此方法存在不足之處，霉菌具有蔓延生長和孢子易飛散的特點(diǎn)，點(diǎn)植時(shí)蘸取的孢子難以確定是由同一株菌繁殖產(chǎn)生，菌落相似的菌株更加難以分辨，不能達(dá)到純化的目的。本研究首先采用點(diǎn)植法多代培養(yǎng)，排除與所需分離菌株外觀不同的雜菌干擾，之后制取其孢子懸液涂布于培養(yǎng)基，以一點(diǎn)為中心生長且不與其他菌落生長相連的單菌落視為純菌落，即由單孢子繁殖而來，在整個(gè)平板所有菌落產(chǎn)孢子前盡快以接種針挑取保藏，此方法雖較繁瑣，但更加嚴(yán)謹(jǐn)。本研究以此方法從9種酒曲中初篩得到13株具有糖化菌特征的霉菌，初篩結(jié)果見表2。

表2 酒曲中菌株分離純化結(jié)果Table 2 Results of isolation and purification of strains from Jiuqu

2.2 糖化菌復(fù)篩

2.2.1 液化力的測(cè)定

在釀酒過程中，液化酶可將淀粉質(zhì)原料水解為糊精、麥芽三糖、直鏈麥芽低聚糖及葡萄糖等微生物所需營養(yǎng)物質(zhì)，有利于發(fā)酵的進(jìn)行，對(duì)酒風(fēng)味的形成也起到一定的促進(jìn)作用，因此液化力是衡量菌株糖化能力的指標(biāo)之一。在35 ℃，pH 4.6的條件下，記錄麩曲浸出液將淀粉完全液化的時(shí)間(以碘液檢驗(yàn))，以1 g 絕干曲1 h能液化的淀粉毫克數(shù)表示液化力，結(jié)果如圖1所示。菌株7M1、5M2、1M5、9M1、1M4、5M3均具有良好的液化力，液化力依次為(1 929±94.55)、(1 868±92.74)、(1 315±46.54)、(1 125±73.84)、(1 130±66.95)、(1 034±65.16) mg/(g·h)，其他菌株液化力均小于1 000 mg/(g·h)。

圖1 13株霉菌所制麩曲液化力Fig.1 Liquefying power of Fuqu made by 13 molds

2.2.2 糖化力的測(cè)定

糖化酶能將淀粉全部轉(zhuǎn)化為葡萄糖，也可以將淀粉液化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為葡萄糖，解決了部分微生物對(duì)非葡萄糖碳源利用率低或不能利用的問題，提高了淀粉利用率，因此糖化力能直接反映菌株糖化能力。在35 ℃，pH 4.6的條件下，用菲林法測(cè)定麩曲浸出液將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的量，以1 g絕干曲1 h轉(zhuǎn)化可溶性淀粉生成葡萄糖的毫克數(shù)表示糖化力，結(jié)果如圖2所示。菌株5M2、1M5和7M1均具有較好的糖化力，糖化力依次為(1 556±15.56)、(1 252 ±63.78)、(1 054±21.11) mg/(g·h)，其他菌株糖化力均小于1 000 mg/(g·h)。

圖2 13株霉菌所制麩曲糖化力Fig.2 Saccharifying power of Fuqu made by 13 molds

在釀酒中，糖化酶水解液化產(chǎn)物為葡萄糖相比于直接水解淀粉更容易且迅速，因此在生產(chǎn)中，液化力和糖化力突出的菌株常搭配使用，達(dá)到最終糖化的目的。綜合分析，菌株1M5、5M2和7M1的液化力及糖化力均突出，具有單獨(dú)使用的潛力。

2.3 糖化菌形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株1M5、5M2和7M1接種在PDA培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)及顯微形態(tài)，如圖3所示。

a-菌株1M5菌落正面、背面和顯微形態(tài)；b-菌株5M2菌落正面、背面和顯微形態(tài)；c-菌株7M1菌落正面、背面和顯微形態(tài)圖3 菌株1M5、5M2和7M1菌落及顯微形態(tài)Fig.3 Morphological characteristics of strains 1M5, 5M2 and 7M1

菌株1M5菌落的正面及背面初為白色，后中心變?yōu)楹谏⑾蜻吘墧U(kuò)散，直徑達(dá)6 cm，邊緣不整齊，菌落疏松呈絮狀，菌絲發(fā)達(dá)。顯微觀察，孢囊梗直立叢生，不分支與假根對(duì)生，直徑達(dá)8～10 μm。孢子囊呈球形，直徑35～50 μm，孢子近似球形，直徑2.5～4 μm，符合根霉特征。

菌株5M2菌落正面初為白色，后中心變?yōu)槟G色并向邊緣擴(kuò)散，背面呈淡黃色，有以接種點(diǎn)為中心放射狀溝紋，直徑達(dá)2.5 cm，邊緣整齊，顯微觀察，孢囊梗直徑達(dá)13～18 μm。孢子囊呈棒狀，長直徑達(dá)40～50 μm，孢子近似球形，直徑3～4.5 μm，符合棒曲霉特征。

菌株7M1菌落正面初為白色，后中心變?yōu)楹谏⑾蜻吘墧U(kuò)散，背面呈淡黃色，直徑達(dá)3 cm。顯微觀察，孢囊梗與基地部位可見足細(xì)胞，孢囊梗直徑達(dá)13～18 μm。孢子囊呈球形，直徑35～45 μm，雙層小梗呈放射狀排列，孢子近似球形，直徑3～5 μm，符合黑曲霉特征。

2.4 糖化菌分子生物學(xué)鑒定

將菌株1M5，5M2和7M1的測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)合鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖4和圖5所示。

圖4 采用鄰接法構(gòu)建菌株1M5與相關(guān)分類群的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree of strain 1M5 and related taxa constructed

圖5 采用鄰接法構(gòu)建菌株5M2、7M1與相關(guān)分類群的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Neighbor-joining phylogenetic tree of strains 5M2,7M1 and related taxa constructed

經(jīng)BLAST比對(duì)，菌株1M5與RhizopusmicrosporusCNM-CM—5165 (JX120681.1)、菌株5M2與AspergillusclavatusHAk 2-M26 (KU052566.1)及菌株7M1與AspergillusnigerCMXY 25845 (MG991652.1)相似性均達(dá)到100%，在系統(tǒng)發(fā)育樹中也分別聚于同一分支，自展值均達(dá)到100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，可以確定菌株1M5為根霉屬的小孢根霉，菌株5M2為曲霉屬的棒曲霉，菌株7M1為曲霉屬的黑曲霉。

2.5 糖化菌糖化試飯效果

將小孢根霉1M5、棒曲霉5M2和黑曲霉7M1制成的麩曲，與實(shí)驗(yàn)室保存的重陽酒曲做對(duì)比，接種到米飯中，使用SBA生物傳感分析儀測(cè)定米飯中葡萄糖含量，結(jié)果如圖6所示。

圖6 小孢根霉1M5、棒曲霉5M2、黑曲霉7M1所制麩曲和重陽酒曲糖化米飯生成的葡萄糖含量Fig.6 Glucose contents of rice saccharified by Chongyang Jiuqu and Fuqu made by strains Rhizopus microsporus 1M5, Aspergillus clavatus 5M2, Aspergillus niger 7M1

發(fā)酵0～24 h，自制酒曲中葡萄糖積累量增加緩慢，24～48 h，葡萄糖積累量快速增加；重陽酒曲中，12 h后葡萄糖開始大量積累，比自制酒曲更早進(jìn)入葡萄糖積累快速增加階段；自制酒曲48～72 h葡萄糖積累緩慢增加，重陽酒曲48～60 h，葡萄糖積累緩慢增加，60～72 h出現(xiàn)葡萄糖積累量下降的情況，自制酒曲60～72 h積累量仍在上升?？芍?種酒曲應(yīng)用到釀酒中，使用重陽酒曲所需糖化培菌時(shí)間更短，但自制酒曲可通過加大酒曲用量提前進(jìn)入葡萄糖大量積累階段，并且縮短糖化時(shí)間。4種酒曲試飯葡萄糖積累量存在差異，小孢根霉7M1酒曲72 h試飯葡萄糖積累量最高、其次為重陽酒曲、棒曲霉1M5酒曲和黑曲霉5M2酒曲，每100 g米飯分別含(21.9±0.66)、(21.43±1.45)、(20.43±1.22)和(18.17±0.93) g葡萄糖。將未加入酒曲的米飯中添加液化酶、糖化酶使米飯全部糖化，測(cè)得100 g米飯含(32.67±1.01) g葡萄糖，通過計(jì)算，酒曲7M1、1M5和5M2的72 h試飯?zhí)腔史謩e為67.04%、62.55%和55.61%，重陽酒曲為65.51%。重陽酒曲60 h葡萄糖積累量達(dá)到最大，最大糖化率為69.79%，之后積累量下降，但自制酒曲60 h后葡萄糖仍在積累，具有超越重陽酒曲最大糖化率的潛力。綜上所述，篩選得到的小孢根霉1M5、棒曲霉5M2和黑曲霉7M1糖化能力良好，具有釀造米酒的潛力。

2.6 糖化菌蛋白酶活力測(cè)定

釀酒過程處于酸性和中性環(huán)境，原料中的蛋白質(zhì)能夠被酒曲中微生物分泌的酸性和中性蛋白酶水解，能夠提供更多的碳源和氨基酸，促進(jìn)微生物生長繁殖[25-27]，改善營養(yǎng)價(jià)值，并且對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味的形成起到重要作用[28-29]。因此制作了L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，并使用Folin-酚法測(cè)定了小孢根霉1M5、棒曲霉5M2和黑曲霉7M1所制麩曲的酸性和中性蛋白酶活力。1 g絕干曲粉，在40 ℃和一定pH值(pH 3：酸性；pH 7.5：中性)條件下，以1 min水解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸的微克數(shù)，表示蛋白酶活力，結(jié)果如表3所示。

在L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度范圍內(nèi)(0～50 μg/mL)線性關(guān)系良好(R2=0.997 4，y=0.010 2x+0.003 3)，符合檢測(cè)要求。由表3可知，黑曲霉7M1酸性蛋白酶活力最大，其次為棒曲霉5M2和小孢根霉1M5。棒曲霉5M2中性蛋白酶活力最大，其次為小孢根霉1M5和黑曲霉7M1。綜合考慮，菌株5M2酸性和中性蛋白酶活力均較高，對(duì)整個(gè)發(fā)酵過程而言，更具有優(yōu)勢(shì)，因此篩選出菌株5M2并使用GC-MS分析其風(fēng)味成分。

表3 小孢根霉1M5、棒曲霉5M2和黑曲霉7M1所制麩曲的酸性及中性蛋白酶活力Table 3 Acid and neutral protease activities of Fuqu made by strains Rhizopus microsporus 1M5, Aspergillus clavatus 5M2 and Aspergillus niger 7M1

2.7 棒曲霉5M2發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

將棒曲霉5M2的孢子懸液接種到米飯培養(yǎng)基發(fā)酵，利用GC-MS對(duì)發(fā)酵代謝的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)過發(fā)酵后，培養(yǎng)基帶有淡淡的花香和果香。棒曲霉5M2發(fā)酵產(chǎn)生的主要特征風(fēng)味物質(zhì)共13種，如表4所示。分為4大類：酸類、烷烴類、酯類、醇類。3-甲基戊酸、苯甲醇、苯乙醇、苯乙酸、十五酸乙酯都有令人愉悅的香味，其中苯乙醇是米香型酒中主體香氣之一[30]，烷烴類、醇類和酸類化合物可以作為風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)，對(duì)產(chǎn)品的口感也起到一定的促進(jìn)作用。

表4 棒曲霉5M2發(fā)酵主要風(fēng)味物質(zhì)Table 4 Main flavor compounds of Aspergillus clavatus 5M2

3 結(jié)論

(1)從酒曲中以孢子分離純化法初篩得到13株具有糖化菌特征的霉菌，經(jīng)復(fù)篩并鑒定得到糖化能力突出的小孢根霉1M5、棒曲霉5M2和黑曲霉7M1，其液化力分別為(1 315±46.54)、(1 868±92.74)、(1 929±94.55) mg/(g·h)，糖化力分別為(1 252±63.78)、(1 556±15.56)、(1 054±21.11) mg/(g·h)。

(2)對(duì)小孢根霉1M5、棒曲霉5M2和黑曲霉7M1進(jìn)行酸性及中性蛋白酶活力測(cè)定，結(jié)果表明菌株5M2分泌的蛋白酶更適用于發(fā)酵，其酸性及中性蛋白酶活力分別為(879±44.34)和(1 207±38.86) μg/(g·min)，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)分析，發(fā)酵產(chǎn)生的3-甲基戊酸、苯甲醇、苯乙醇、苯乙酸和十五酸乙酯都有令人愉悅的香味。

(3)小孢根霉1M5、棒曲霉5M2和黑曲霉7M1在米酒釀造中具有應(yīng)用潛力。