孫潔，李燕，施文正，汪之和

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖和捕撈大國，其中蝦類資源豐富，2019年我國蝦類年產(chǎn)量約為685萬t[1]。在捕撈過程中獲得個體小、價格低的蝦及加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物統(tǒng)稱為低值蝦，包括毛蝦及各類蝦頭、蝦殼、蝦尾等，約占總產(chǎn)量的40%。目前蝦及其副產(chǎn)物多被用來制作蝦醬、飲料、海鮮風(fēng)味料或作飼料、肥料，蝦頭、蝦殼等因富含活性物質(zhì)可用來提取蝦青素、蝦油和甲殼素等，但在化學(xué)加工中可能造成資源二次浪費或增加成本，故以生物轉(zhuǎn)化的方式提高低值蝦的利用率已成為近年來的研究熱點。

生物活性肽是蛋白質(zhì)通過發(fā)酵或酶解后經(jīng)分離純化得到的具有特定生理功效的肽段或氨基酸[2]，現(xiàn)已從不同物質(zhì)中鑒定出3 200多類生物活性肽[3]，因氨基酸組成不同而具有不同功能特性。與人工合成的活性物質(zhì)相比，生物活性肽具有選擇性生理作用、易消化吸收、無毒副作用等突出優(yōu)勢[4]。目前，活性肽的來源主要為植物及乳制品，以蝦類及其副產(chǎn)物為原料制備生物活性肽，不僅充分利用水產(chǎn)資源、減少污染，而且從不同蝦類蛋白肽中鑒定出的多種生物活性表明，蝦及其副產(chǎn)物可作為活性肽的良好來源應(yīng)用于醫(yī)藥和食品領(lǐng)域，具有開發(fā)保健食品的潛能和較大的經(jīng)濟效益。本文從蝦類生物活性肽的分離純化與鑒定、活性類型及結(jié)構(gòu)特征等方面進行綜述，完整地展現(xiàn)蝦類生物活性肽的應(yīng)用，為蝦類活性肽的繼續(xù)開發(fā)和蝦類高值化利用提供參考。

1 蝦類生物活性肽的分離提取

1.1 自溶作用

蝦體內(nèi)除營養(yǎng)成分外還富含活性很高的內(nèi)源酶，包括蛋白酶、磷酸酶、核酸酶和羧肽酶等[5]，其中蝦頭中蛋白酶的種類和含量甚至高于蝦肉。在一定條件下內(nèi)源酶被激活，釋放至周圍與相應(yīng)的機體組織反應(yīng)、蛋白質(zhì)發(fā)生降解，從而引起蝦的自溶作用。蝦中的蛋白質(zhì)以氨基酸、肽和可溶性蛋白質(zhì)的形式釋放出來[6]，這是獲得蝦類活性物質(zhì)的一種常見方式。為提高自溶作用產(chǎn)生蛋白質(zhì)的得率，除了從溫度、pH、反應(yīng)時間和底物濃度等因素優(yōu)化自溶條件外，還可使用超聲波[7]、紫外照射[8]等技術(shù)輔助或誘導(dǎo)自溶。但自溶作用過程中內(nèi)源酶的種類較多且常與外源酶共同作用，這就不可避免地產(chǎn)生組分復(fù)雜的產(chǎn)物[6]，且細(xì)菌迅速繁殖導(dǎo)致蝦類腐敗，常采用物理方法或化學(xué)技術(shù)等破壞細(xì)胞組織或抑制酶的活性，從而調(diào)控自溶作用的進程。

1.2 外源酶水解

制備多肽最常用的方法是酶解法，即蛋白質(zhì)以一定比例與水復(fù)配后加入適量蛋白酶進行水解。常用的酶制劑有堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、動物蛋白酶和木瓜蛋白酶等，不同蝦類多肽酶解條件見表1。因酶解位點不同所得多肽的活性也有所不同，付雪艷等[9]分別使用堿性蛋白酶和中性蛋白酶水解中國毛蝦，結(jié)果顯示堿性酶解多肽具有一定的降壓作用。

表1 不同蝦類蛋白源多肽的酶解條件Table 1 The enzymatic hydrolysis conditions of different shrimp protein source peptides

單個酶制劑對蛋白質(zhì)的水解作用有限，可使用超聲波[10]、微波[11]等技術(shù)輔助酶解從而提升水解效果。將2種或多種酶復(fù)合使用可顯著提高蛋白水解程度和多肽得率。李靜等[12]分別用5種蛋白酶于各自適宜條件下酶解低值蝦粉，從中優(yōu)選出中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶并且通過復(fù)合配制這2種蛋白酶制備得到42.93%呈味肽，這主要體現(xiàn)了中性蛋白酶的無明顯選擇性，又體現(xiàn)木瓜蛋白酶的專一性[13]。通過胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同作用，可在一定程度上模擬體外胃腸消化過程所獲多肽。李銳等[14]利用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶復(fù)合酶解克氏原螯蝦蝦頭，得到的模擬消化產(chǎn)物具有一定降壓活性，并經(jīng)分離純化能夠得到活性更高的新型肽。

1.3 食品加工

蝦類通過特定食品加工過程也可獲得具有生物活性的物質(zhì)。在發(fā)酵過程中，微生物作用不僅使蝦醬產(chǎn)生特殊風(fēng)味還具有更強的抗氧化活性[28]，KLEEKYAI等[29]從泰國傳統(tǒng)發(fā)酵蝦醬中分離純化出抗氧化肽和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制肽，但發(fā)酵過程難以控制且時間長故較少使用。此外，實驗證明美拉德反應(yīng)可顯著增強蛋白質(zhì)、肽和氨基酸的功能特性和抗氧化活性[30]。汪清等[31]對比克氏原螯蝦蛋白肽及其美拉德產(chǎn)物的抗氧化活性得知，蛋白肽美拉德反應(yīng)后還原力、羥自由基清除能力和DPPH自由基清除能力均增大，表明美拉德反應(yīng)可有效提高克氏原螯蝦蛋白肽的抗氧化能力，這可能由于肽在美拉德反應(yīng)中羥基和吡咯基團的電子轉(zhuǎn)移活性以及還原酮的供氫能力終止了自由基鏈反應(yīng)[32]。

2 蝦類生物活性肽的分離純化及鑒定

在分離純化過程中，通常采用多種方法使組分復(fù)雜且分子質(zhì)量相近的蛋白水解物經(jīng)逐步分離純化得到較為純凈且活性較高的肽段：首先采用超濾將蛋白水解物分成分子質(zhì)量不同的組分，然后選出活性最高的組分經(jīng)凝膠過濾層析或離子交換色譜二次分離，最后對最高活性組分使用高效液相色譜(HPLC)進行純化。因肽的分子質(zhì)量一般小于10 kDa，柱層析時常選擇sephadex G系統(tǒng)進行分離。固相萃取技術(shù)也是常用來分離和富集化合物的一種技術(shù)，固體吸附劑將液體中的目標(biāo)物質(zhì)吸附后再通過加熱解吸附或洗脫液直接洗脫，其中洗脫條件對目標(biāo)肽段的活性具有顯著影響[33]。為得到更好的純化效果，胡川[34]先對比了超濾膜和納濾膜對去除小龍蝦蝦殼酶解液中的大分子蛋白質(zhì)、多糖及小分子鹽類之間的差異，結(jié)果顯示超濾過程需經(jīng)過2次過濾而對蛋白質(zhì)損失較高，而納濾后的酶解液不僅除鹽率高還具有濃縮作用；然后又比較G25葡聚糖凝膠柱、SPE固相萃取柱和superdex 30pg 葡聚糖凝膠柱對于小龍蝦蝦殼多肽分離純化的效果，其中superdex 30pg 葡聚糖凝膠柱可達到進一步除鹽的效果。

純化后的肽段要通過結(jié)構(gòu)鑒定確定其氨基酸序列，常用的活性肽結(jié)構(gòu)鑒定方法有質(zhì)譜法、核磁共振法、紫外光譜法等。根據(jù)電離源和分析器的不同，質(zhì)譜法可分為多種類型，在鑒定不同活性肽時常使用不同技術(shù)，如二肽基肽酶-IV抑制肽的鑒定常用三重四級桿質(zhì)譜法(TSQ-MS)和基層輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-ToF-MS)法[17]，鑒定ACE抑制肽時使用電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)[35]等。毛細(xì)管電泳-飛行時間質(zhì)譜(CE-ToF-MS)可對百余種可溶性肽同時分析，適合對大分子物質(zhì)進行分離分析并極大地縮短鑒定時間[36]，但常用于檢測紫外吸收較弱的化合物。制備蝦類生物活性肽的具體操作流程見圖1。

圖1 制備蝦類生物活性肽的常規(guī)流程Fig.1 Routine process for preparing shrimp bioactive peptides

3 蝦類生物活性肽的功能活性

目前已從不同蝦及其副產(chǎn)物中鑒定出多種功能活性，包括抗氧化、降血壓、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗菌和金屬結(jié)合等活性。主要蝦類生物活性肽的獲得方式、功能活性、結(jié)構(gòu)特征及活性評價見表2。

表2 主要蝦類生物活性肽Table 2 The main bioactive peptides from shrimps

續(xù)表2

3.1 抗氧化活性

活性肽作為生物抗氧化劑可通過多種途徑抑制脂質(zhì)氧化和其他 生物分子氧化，包括活性氧失活、清除自由基、金屬螯合、氫過氧化物減少等。因為肽段比完整的蛋白質(zhì)具有更高的抗氧化活性，所以蛋白質(zhì)水解生成肽類是獲得抗氧化劑的更好方式[37]。已有研究表明多種蝦類及其副產(chǎn)物是抗氧化肽的良好來源。現(xiàn)從凡納濱對蝦[15](3 kDa～10 kDa)、南極磷蝦[16](311～2 963 Da)、竹節(jié)蝦[10](Gly-Asn-Gly-Leu-Pro，455.99 Da)、克氏原螯蝦[22]、蝦蛄[27]等蛋白酶解產(chǎn)物中鑒定出抗氧化肽，經(jīng)總結(jié)得知分子質(zhì)量約為300～3 000 Da，并富含Gly、Leu、Pro等疏水性氨基酸，有些分子質(zhì)量為3 kDa～10 kDa的蛋白質(zhì)也顯示出一定的抗氧化活性。由于抗氧化活性的評價指標(biāo)較多且未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，故不同文獻會采用不同指標(biāo)反映其活性，一般來說蝦類抗氧化肽的DPPH自由基清除率為50%～87%，羥自由基清除率為53%～89%，超氧陰離子自由基清除力為21%～29%，還原力為0.033～0.243，或因蝦的種類、酶解條件及分離純化程度的不同導(dǎo)致結(jié)果存在差異。

3.2 降壓活性

高血壓是一種常見的心血管疾病，影響我國約25%的成年人。目前使用的降壓藥多為人工合成，雖然可以顯著降低血壓，但存在明顯副作用，而來源于蝦類的降血壓肽因具有天然安全、無毒副作用等優(yōu)勢已逐漸被人重視。降壓肽是一類對ACE有抑制作用的活性肽，通過抑制ACE阻止血管緊張素I型轉(zhuǎn)化為具有收縮血管作用的II型，同時阻礙擴張血管的緩激肽降解，又稱為ACE抑制肽。ZHANG和CAO等[24-38]從中國毛蝦胃蛋白酶水解物中分離出2條短肽(Leu-His-Pro和Val-Trp)，二者均具有ACE抑制活性且前者的抑制率高達92.7%，經(jīng)對自發(fā)性高血壓大鼠進行動物實驗表現(xiàn)出顯著的降壓作用。有研究表明蝦類降血肽的ACE抑制活性與Trp、Leu、Val等疏水性氨基酸含量有關(guān)。CHEUNG等[39]研究蛋白酶類型等因素對異擬長額蝦(Pandalopsisdispar)加工副產(chǎn)物水解物的影響，結(jié)果顯示由堿性磷酸酶和復(fù)合蛋白酶水解得到的產(chǎn)物具有較強的ACE抑制活性，但因含有大量疏水性氨基酸而具有強烈苦味。

3.3 降糖活性

糖尿病是以高血糖為主要特征的代謝性疾病，現(xiàn)已成為繼惡性腫瘤、心血管疾病之后的世界第三大慢性疾病，其中II型糖尿病占95%，降血糖肽因作用機制不同可分為α-葡萄糖苷酶抑制肽、α-淀粉酶抑制肽、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑制肽等。蝦類生物活性肽的降血糖作用主要是通過抑制DPP-IV酶實現(xiàn)的。DPP-IV抑制肽通過降低腸上皮細(xì)胞分泌的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)和抑胃肽(GIP)等激素的降解速率，提高內(nèi)源性GLP-1和GIP水平，促進合成胰島素并保護胰島β細(xì)胞，達到降低II型糖尿病患者餐后血糖的作用。目前國內(nèi)外對于蝦類DPP-IV抑制肽的研究較少，KETNAWA等[40]在熟制的南美白對蝦蛋白酶水解液中測定出DPP-IV抑制活性(抑制率為22.7%～66.7%)，且酶解液的DPP-IV抑制活性顯著高于未水解的蛋白，這表明了酶解可增強蛋白質(zhì)的DPP-IV抑制活性，但該實驗未繼續(xù)分離純化得到特定的肽段。吉薇[17]從南極磷蝦蛋白中分離出3條DPP-IV抑制肽(Ala-Pro、Ile-Pro-Ala和Ile-Pro-Ala-Val-Phe)，它們的分子質(zhì)量為100～3 000 Da，這表明DPP-IV抑制肽多含Ile、Val、Pro等疏水性氨基酸和Ala等氨基酸組成。

3.4 免疫調(diào)節(jié)活性

具有免疫調(diào)節(jié)功能的生物活性肽在細(xì)胞或動物實驗中常顯示出免疫調(diào)控作用[41]，目前蝦類活性肽的免疫調(diào)節(jié)作用多顯示于小鼠體內(nèi)實驗中。徐愷[18]研究南極磷蝦肽對小鼠提高免疫力等方面的影響，結(jié)果顯示南極磷蝦肽能夠提高小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖速度、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、抗體生成細(xì)胞數(shù)、血清溶血素水平、吞噬細(xì)胞碳廓清能力和NK細(xì)胞活性，證明南極磷蝦肽能夠顯著提高小鼠免疫力。卜天等[26]研究表明蝦蛄多肽在最佳酶解條件下對小鼠巨噬細(xì)胞具有最高細(xì)胞活性并促進其吞噬能力。但國內(nèi)對于蝦類免疫調(diào)節(jié)肽的研究主要體現(xiàn)肽的功能活性，對其結(jié)構(gòu)特征未有深入研究。

3.5 抗菌活性

抗菌肽能夠抵抗微生物入侵起到保護宿主的作用，在發(fā)揮抑菌作用時具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性的特點[42]?？咕牡慕Y(jié)構(gòu)較為獨特，分子質(zhì)量一般大于1 000 Da，含有10～50個氨基酸殘基，包括數(shù)個帶正電荷的氨基酸殘基或在酸性條件下帶有組氨酸，并且疏水性結(jié)構(gòu)占比超過一半[43]。雖然蝦類多肽對革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌都具有較好的抑制作用，但來源于不同原料的多肽其抑菌作用也有所差異。趙玲[19]篩選南極磷蝦多肽各級組分對金黃色葡萄球菌等6種菌的抑菌作用，結(jié)果顯示中性蛋白酶和堿性蛋白酶復(fù)合酶解多肽對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最明顯。PAN等[44]從日本沼蝦中分離純化出的蛋白MjRCP75對金黃色葡萄球菌(G+)、大腸桿菌(G-)和副溶血性弧菌(G-)均顯示出明顯的抗菌活性，其中對副溶血性弧菌的抑制作用最強。

3.6 金屬結(jié)合活性

金屬結(jié)合肽就是處于肽中心位置磷酸化的絲氨酸基團和谷氨酰殘基與金屬元素螯合后阻礙金屬離子相互作用的活性肽，不僅可增強肽與金屬元素復(fù)合物的溶解度[45]，而且某些抗氧化活性也是通過螯合后抑制金屬離子在生物氧化中傳遞而實現(xiàn)的，常見的螯合礦物元素有鈣、鋅、鐵等。陳麗麗等[23]用木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解克氏原螯蝦的副產(chǎn)物提取多肽并與Zn2+螯合，最佳工藝下螯合物產(chǎn)率達70.7%。鐵離子結(jié)合肽因來源豐富故結(jié)合位點較多。HUANG等[46]研究通過堿性蛋白酶水解分離蝦加工副產(chǎn)物中的鐵結(jié)合肽，結(jié)果顯示水解度為8%的水解產(chǎn)物其鐵結(jié)合能力最強；通過與鐵結(jié)合肽和鐵肽復(fù)合物的紅外光譜比較，表明鐵的結(jié)合位點主要在羧酸根基團。

4 蝦類生物活性肽的結(jié)構(gòu)特征

4.1 分子質(zhì)量

蝦類生物活性肽因原料及蛋白酶種類不同而水解度不同，分子量也有所差異，一般來說生物活性肽的分子質(zhì)量小于6 kDa[47]，這是因為低分子質(zhì)量的肽更容易穿過胃腸屏障與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合發(fā)揮作用。經(jīng)總結(jié)發(fā)現(xiàn)抗氧化肽的分子質(zhì)量通常為300～5 000 Da；ACE抑制肽的分子質(zhì)量一般為200～3 000 Da；DPP-IV抑制肽分子質(zhì)量為100～3 000 Da；免疫調(diào)節(jié)肽的結(jié)構(gòu)特征研究較少，故其分子質(zhì)量范圍較模糊；抗菌肽中以大分子肽(>1 kDa)為主，也有部分是小分子肽(<1 kDa)；金屬結(jié)合肽的分子質(zhì)量與螯合活性間存在一定聯(lián)系，一般認(rèn)為鐵螯合肽的分子質(zhì)量在1 000 Da以下，鋅螯合肽分子質(zhì)量小于550 Da。同一種蝦使用不同酶制劑水解得到的抗氧化肽分子質(zhì)量也有所差別。鄭景如等[48]使用胰蛋白酶優(yōu)選南極磷蝦蛋白肽具有抗氧化活性的組分，其中分子質(zhì)量小于3 kDa的組分ABTS自由基清除作用最佳，分子質(zhì)量為3 kDa～10 kDa的組分DPPH自由基清除率高。李芙蓉[13]對復(fù)合酶水解南極磷蝦蝦粉多肽的分子質(zhì)量和生物活性進行研究，得知分子質(zhì)量為5 kDa～10 kDa的多肽具有抗氧化活性，其中疏水性氨基酸在清除DPPH自由基和羥自由基中起主要作用。

4.2 氨基酸序列

氨基酸種類和序列是決定蝦類多肽生物活性的主要因素。一般來說蝦類抗氧化肽、ACE抑制肽和DPP-IV抑制肽多含Leu、Ile、Val、Pro等疏水性氨基酸及Phe、Trp等芳香族氨基酸。ZHAO等[20]從南極磷蝦中分離出8種降壓肽均為2～4肽，且第一位點氨基酸為Trp或Phe。DPP-IV抑制肽常為2～11肽，JI等[49]使用動物蛋白酶水解南極磷蝦蛋白，采用超濾、凝膠色譜柱和RP-HPLC對水解物分離純化后經(jīng)QTof-MS鑒定出Ala-Pro(AP)和Ile-Pro-Ala(IPA)2種DPP-IV抑制肽；分子對接分析表明AP和IPA對DPP-IV抑制作用主要是由于它們與DPP-IV中91～96和101～105號氨基酸形成了強大的相互作用表面力。這表明氨基酸數(shù)量較少且多為疏水性氨基酸的結(jié)構(gòu)可能便于多肽的運輸并與作用位點結(jié)合?？咕亩嗪杷园被峒八嵝园被?。JIRAVANICHPAISA等[50]從克氏原螯蝦中分離純化出一種具有14個氨基酸殘基的抗菌肽(astacidin 2)，其中富含脯氨酸/精氨酸，采用MALDI-ToF-MS測定得到其主要序列是帶有酰胺化C末端的RPRPNURPRPIYRP，分子質(zhì)量為1 838 Da。抗菌肽astacidin 2對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有較強的抑制作用，并且可以通過使用2種蛋白酶對N末端和C末端進行處理后合成為前肽。金屬結(jié)合肽的結(jié)合能力與氨基酸殘基密切相關(guān)，其中谷氨酸、天冬氨酸和組氨酸的含量在肽與Zn2+、Ca2+結(jié)合過程中至關(guān)重要。何晨[21]以南極磷蝦為原料制備高純度的金屬結(jié)合肽，結(jié)果顯示胰蛋白酶水解肽的Zn2+、Fe2+和Ca2+結(jié)合能力最強，這與分子質(zhì)量和酸性氨基酸含量有關(guān)，表明南極磷蝦肽可作為金屬離子的有效載體。全沁果[51]使用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解南極磷蝦并采用硫酸鋅法制備南極磷鋅螯合肽，在最佳工藝條件下得到的磷蝦肽其鋅離子螯合率高達76.31%，其中Asn、Glu、Lys、His和Cys含量明顯上升。

5 展望

目前對蝦類生物活性肽的研究越來越多，但研究進展相對比較緩慢，希望未來的研究可在以下幾個方面有所突破：

(1)擴大功能性研究：此前研究中原料的選擇主要包括南極磷蝦、克氏原螯蝦、凡納濱對蝦、中國毛蝦等，對于其他蝦類及其副產(chǎn)物的研究還不是很多；已鑒定的活性肽中抗氧化肽、金屬結(jié)合肽和ACE抑制肽較多，對免疫活性和降血糖活性的研究甚少。故在今后的實驗中可以擴大原料選擇范圍并對更多活性功能展開研究。

(2)作用機理研究：在目前的研究中對蝦類生物活性肽多為體外定性鑒定，少數(shù)文章進行動物實驗及定量研究，而且對于某些活性肽的作用機理尚不明確。因此可將蝦類活性肽的定量實驗作為研究重點并在不同動物模型中進行體內(nèi)活性測定，同時確定其活性機制。

(3)產(chǎn)品開發(fā)研究：從蝦中獲取生物活性肽的目的是為了將功能食品應(yīng)用于人體健康管理，故對于活性肽的色、香、味等感官要求較高，但大部分生物活性肽因含有疏水性殘基而不可避免地產(chǎn)生苦味，所以減輕或消除肽的苦味而保留生物活性也是值得關(guān)注的研究方向。