高云龍，馬健波，張睿，武倫，魏澗，高嘉良，茍志敏，劉一魁

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬國(guó)藥東風(fēng)總醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

腎移植是治療終末期腎臟病最有效的治療手段，也是改善患者生活質(zhì)量最好的方法。目前由于供體腎臟資源的緊缺，為了供腎與患者更好的匹配，減少排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)腎臟使用年限，供體腎臟需要穿刺活檢對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。最近文獻(xiàn)報(bào)道Klotho蛋白的異常表達(dá)與慢性腎臟病[1-3]、急性腎損傷[4]以及缺血在灌注損傷[5-6]有關(guān)。Klotho蛋白是由klotho基因編碼的一種單向跨膜蛋白，主要在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)，相關(guān)研究也證實(shí)了Klotho蛋白確實(shí)與腎上皮細(xì)胞衰老有關(guān)[7]，并且發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白有部分腎臟的功能，如調(diào)節(jié)1，25(OH)2D3、磷酸鹽[8-9]。然而關(guān)于Klotho蛋白在移植腎臟中的研究較少。因此，我們研究Klotho蛋白在供腎零點(diǎn)穿刺組織中的作用，旨在探討Klotho蛋白表達(dá)情況與供腎零點(diǎn)穿刺病理結(jié)果之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2019年1月至2020年8月期間，我院DCD供腎零點(diǎn)穿刺活檢的石蠟標(biāo)本及病理報(bào)告，共42例(左右腎臟)，其中未在本院行手術(shù)9例，蠟塊標(biāo)本組織在切片時(shí)未見(jiàn)組織1例，其余32例，其中男20例，女12例，平均(56.44±6.90)歲。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(LW-2021-002)。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

(1)符合器官捐贈(zèng)標(biāo)準(zhǔn)；(2)術(shù)后受者未發(fā)生超級(jí)性排斥反應(yīng)及急性排斥反應(yīng)；(3)無(wú)移植腎功能延遲恢復(fù)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)供者有明顯的心、肝功能不全；(2)供者病例資料不全者；(3)合并傳染性疾病者。

1.4 分組

根據(jù)術(shù)前病理科對(duì)供腎零點(diǎn)穿刺組織病理結(jié)果Remuzzi分級(jí)評(píng)分，將32例按照總評(píng)分的平均值分為高分組(8.13±1.50)和低分組(3.81±1.11)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

檢測(cè)32例供腎零點(diǎn)穿刺組織不同Remuzzi病理分級(jí)評(píng)分石蠟切片中Klotho蛋白表達(dá)情況。

1.6 檢測(cè)方法(免疫組織化學(xué)手工染色法)

制片：將收集的石蠟放入冰箱中冷凍片刻，取出后進(jìn)行切片處理，厚度約為4 μm，70 ℃烤片2 h。

脫蠟：將玻片分2次浸泡在二甲苯溶液中(5分鐘/次)，再浸泡在無(wú)水乙醇中5 min，然后依次用無(wú)水乙醇、95%、75%濃度的酒精快速洗滌，清水沖洗2～3次后吹干。

水化：將載玻片置于搖擺床用PBS液洗3次(3分鐘/次)。

抗原修復(fù)：采用高壓鍋加熱檸檬酸溶液，其操作步驟為：將玻片置于其中，開(kāi)火待煮沸后計(jì)時(shí)150 s后，關(guān)火冷卻15 min，再將玻片置于PBS溶液中(方法同前)。

封閉：為封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶及蛋白質(zhì)，將玻片置于3%過(guò)氧化氫溶液中浸泡10 min后，繼續(xù)用PBS液洗片。

滴加一抗(40 μL，Anti-Klotho抗體，abcam，美國(guó))：根據(jù)組織大小滴加適量稀釋比為1∶300的一抗，并恒溫維持在4 ℃孵育過(guò)夜；復(fù)溫1 h后PBS溶液洗3次(方法同前)。

滴定二抗(50 μL，由武漢安捷特生物技術(shù)有限公司進(jìn)口分裝，武漢市洪山區(qū)街道口京韻花園B-2601)檢測(cè)試劑：取適量稀釋比為1∶300的二抗滴于玻片，輕輕晃動(dòng)后，孵育30 min，再次洗片3次。

DAB顯色(DAB顯色試劑盒，3 mL，北京中杉生物技術(shù)有限公司)：配制DAB顯色工作液(濃縮DAB溶液50 μm與DAB底物液1000 μm)必須即配即用，顯色8 min。

生態(tài)學(xué)是一門(mén)綜合性、實(shí)踐性很強(qiáng)的學(xué)科。室內(nèi)實(shí)驗(yàn)與野外調(diào)查相結(jié)合是生態(tài)學(xué)教學(xué)中一項(xiàng)十分重要的教學(xué)活動(dòng)，是檢驗(yàn)理論知識(shí)掌握得牢固與否的主要手段。

脫水：將膠片分別在濃度為75%的酒精、95%的酒精、無(wú)水乙醇中快速洗滌，然后依次在無(wú)水乙醇和二甲苯中浸泡5 min，換二甲苯再次浸泡5 min后，將膠片吹干、封片、閱片。

1.7 研究方法

供腎零點(diǎn)穿刺病理結(jié)果根據(jù)Remuzzi病理分級(jí)評(píng)分，據(jù)腎小球硬化比例、腎間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮、腎間質(zhì)炎癥、小動(dòng)脈內(nèi)膜纖維化增厚、動(dòng)脈透明樣變、腎小球內(nèi)微血栓、腎小管損傷、壞死病理學(xué)表現(xiàn)，若無(wú)上述情況計(jì)為0分；輕度1分；中度2分；重度3分[10]，評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1，HE染色病理結(jié)果見(jiàn)圖1。腎臟各自的評(píng)分據(jù)32例總評(píng)分的平均值分為兩組，每組各16例；將收集到的32例石蠟組織制備的標(biāo)本玻片由病理科資深醫(yī)生隨機(jī)選取3個(gè)清晰視眼采圖，利用Fiji-ImageJ軟件計(jì)算采集圖片的陽(yáng)性面積所占百分比，取其平均值進(jìn)行分析計(jì)算，并使用Graphpad Prism 8軟件完成箱線圖，分析兩組之間Klotho蛋白表達(dá)有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 供腎活檢組織病理學(xué)表現(xiàn)評(píng)分表

Aa供腎零點(diǎn)穿刺病理結(jié)果未見(jiàn)腎小球硬化，未見(jiàn)腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生，血管內(nèi)未見(jiàn)管壁玻璃樣變及內(nèi)膜增厚，間質(zhì)未見(jiàn)纖維組織增生，可見(jiàn)個(gè)別炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，與b來(lái)源于同一腎臟組織。a、b、c為HE 100×，d為HE 200×

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 Remuzzi病理分級(jí)評(píng)分分組結(jié)果

根據(jù)供腎零點(diǎn)穿刺病理結(jié)果病理學(xué)表現(xiàn)評(píng)分按總的平均值分為兩組，每組16例，總平均值為5.97。高分組(8.13±1.50)，其中男7例，女9例；低分組(3.81±1.11)，其中男13例，女3例。

2.2 Klotho蛋白在組織中的表達(dá)情況

按照Remuzzi分級(jí)評(píng)分高低分兩組，檢測(cè)Klotho蛋白表達(dá)情況，分析兩組之間Klotho蛋白表達(dá)差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們的研究結(jié)果如下：Remuzzi分級(jí)評(píng)分高分組(21.61%±8.24%)，Remuzzi分級(jí)評(píng)分低分組(49.90%±9.71%)，兩組之間Klotho蛋白表達(dá)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.36，P<0.001)，見(jiàn)圖2～4。

左100×，右400×

左：100×，右：400×

圖4 Remuzzi病理評(píng)分兩組之間Klotho蛋白表達(dá)情況

2.3 組織Klotho蛋白表達(dá)與年齡相關(guān)關(guān)系

統(tǒng)計(jì)32例腎臟組織Klotho蛋白表達(dá)平均水平(35.76%±16.88%)，供腎零點(diǎn)穿刺組織中Klotho蛋白表達(dá)與供腎年齡沒(méi)有發(fā)現(xiàn)線性相關(guān)關(guān)系，見(jiàn)圖5。

2.4 組織Klotho蛋白表達(dá)與Remuzzi病理結(jié)果評(píng)分相關(guān)關(guān)系

發(fā)現(xiàn)供腎零點(diǎn)穿刺組織中Klotho蛋白表達(dá)(%)與其對(duì)應(yīng)病理結(jié)果高度相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.834，P<0.001)，見(jiàn)圖6。

r=-0.033，P<0.859

3 討 論

本報(bào)告是對(duì)32例我院DCD供腎零點(diǎn)穿刺組織病理Remuzzi病理結(jié)果評(píng)分與其對(duì)應(yīng)組織中Klotho蛋白表達(dá)情況之間關(guān)系的研究。其人群特點(diǎn)：其中男20例，女12例，平均(56.44±6.90)歲，獲取前的評(píng)估均符合腎臟器官捐贈(zèng)標(biāo)準(zhǔn)，供腎者既往史沒(méi)有高血壓、糖尿病、腎炎及嚴(yán)重傳染病史，在移植術(shù)后均未出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)及移植腎失功。

腎移植手術(shù)能夠給尿毒癥患者帶來(lái)最大的受益，但對(duì)供腎質(zhì)量的評(píng)估，目前仍缺乏一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，零點(diǎn)穿刺病理檢查是評(píng)估供腎質(zhì)量的一種重要方法，其優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在供腎組織形態(tài)學(xué)改變上。近期大量研究發(fā)現(xiàn)Klotho在基因及蛋白表達(dá)分子層面對(duì)腎臟有一定保護(hù)作用[11-12]，這可能與Klotho蛋白能夠降低炎癥因子、抑制氧化應(yīng)激介質(zhì)的產(chǎn)生[13-14]、抑制纖維化[15]有關(guān)。

我們通過(guò)對(duì)供腎零點(diǎn)穿刺組織HE染色，Remuzzi病理結(jié)果評(píng)分進(jìn)行分組，并對(duì)相對(duì)應(yīng)的各組中零點(diǎn)穿刺組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色測(cè)定石蠟標(biāo)本中Klotho蛋白的表達(dá)。在手術(shù)前病理科對(duì)供腎零點(diǎn)穿刺病理結(jié)果根據(jù)Remuzzi分級(jí)評(píng)分分為兩組，發(fā)現(xiàn)兩組分別對(duì)應(yīng)Klotho蛋白陽(yáng)性表達(dá)面積百分比之間的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)見(jiàn)圖4；與此同時(shí)我們進(jìn)一步通過(guò)線性回歸方法分析了32例Remuzzi分級(jí)評(píng)分與對(duì)應(yīng)供腎零點(diǎn)穿刺組織中Klotho蛋白表達(dá)陽(yáng)性面積百分比之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)供腎零點(diǎn)穿刺組織中Klotho蛋白的表達(dá)與其Remuzzi分級(jí)評(píng)分之間有高度相關(guān)性(r=-0.834，P<0.001)，圖1與圖2來(lái)源于同一組織。之前有研究報(bào)道[16]顯示Klotho蛋白表達(dá)與年齡有一定的關(guān)系，因此我們也分析了供腎零點(diǎn)穿刺組織中Klotho蛋白的表達(dá)與年齡之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)供腎零點(diǎn)穿刺組織中Klotho蛋白的表達(dá)與年齡之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性(r=-0.033，P=0.859)，這一結(jié)果與上述報(bào)道結(jié)果不一致，可能源于個(gè)體之間的差異或者標(biāo)本不同、樣本量有關(guān)。

觀察免疫組織化學(xué)染色病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白表達(dá)主要分布于細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)，尤其是多見(jiàn)于Remuzzi分級(jí)評(píng)分低分組，然而我們知道Klotho蛋白表達(dá)主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，因此我們猜測(cè)胞漿的陽(yáng)性表達(dá)與細(xì)胞膜分泌有關(guān)，這一結(jié)果在之前報(bào)道已經(jīng)得到證實(shí)[17]，他們研究發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白有自分泌與旁分泌功能。這一觀點(diǎn)與我們研究結(jié)果是一致的，認(rèn)為胞漿內(nèi)可見(jiàn)褐色染色來(lái)源于細(xì)胞膜的表達(dá)。

綜上所述，Klotho蛋白在供腎零點(diǎn)穿刺組織不同病理結(jié)果中的表達(dá)有醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。目前零點(diǎn)穿刺病理檢查是評(píng)估供腎質(zhì)量的一種重要手段，能夠客觀地對(duì)組織形態(tài)改變進(jìn)行評(píng)價(jià)，而腎臟組織Klotho蛋白研究主要在分子水平。因此，兩者結(jié)合可以對(duì)腎臟組織形態(tài)學(xué)及分子水平綜合評(píng)價(jià)，對(duì)供腎質(zhì)量更全面地了解，能更準(zhǔn)確地評(píng)估供腎功能水平。當(dāng)然由于我院腎臟移植手術(shù)數(shù)量有限、納入本研究的病例樣本例數(shù)相對(duì)較少，供腎零點(diǎn)穿刺組織較小，其結(jié)論仍然需要多中心聯(lián)合、擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證，并且對(duì)供受者血液中Klotho蛋白的檢測(cè)有待進(jìn)一步研究，以便為術(shù)后腎功能檢測(cè)提供一定理論依據(jù)，為臨床醫(yī)生提供腎移植術(shù)后潛在治療靶點(diǎn)。